[發明專利]一種海水中重金屬鎘污染的生物學靈敏檢測方法

有效

• 申請號: 201210316610.3
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102808036A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 潘寶平;張麗巖;羅凱婭
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本申請得到天津市科委應用基礎及前沿技術重點項目（12JCZDJC22800）和天津市科委應用基礎及前沿技術重點項目（09JCZDJC19300）的資助。

技術領域

本發明屬于海洋污染的生物探針監測領域，涉及水生動物分子生物學技術，具體的說是一種新型、高效、靈敏的海水重金屬鎘的生物學檢測方法。

背景技術

近年來，隨著我國采礦、冶煉、陶瓷、電鍍、顏料及電子工業的迅猛發展，使鎘、砷、汞等有害重金屬以工業“三廢”形式大量排放到自然界，不僅對耕地等土壤環境造成污染，還會隨水體的地表及地下徑流進入海洋，對近岸水體造成嚴重污染。其中，我國環渤海區域近岸海域水體重金屬鎘（Cd²⁺）的污染尤為嚴重。重金屬鎘的污染不僅具有范圍廣，持續時間長，不易在生物體內分解排放和污染后難以發現等特點，且可沿食物鏈轉移進而在人體內富集，對人類健康造成嚴重危害。因此，重金屬鎘的污染已經成為全社會普遍關注的熱點問題，也是國內外學者面臨的重要研究命題之一。

鎘（Cd）原子量112.41，在周期表中屬ⅡB族元素。鎘溶于酸但不溶于堿，其氧化態為Cd^＋1和Cd^＋2。鎘可形成多種配離子，如Cd(NH₃）、Cd(CN)、CdCl等。鎘對動植物毒性較大，被其污染的空氣和食物對人體危害嚴重。早在上世紀中期，日本富山縣神通川流域河岸出現的“痛痛病”，即患者出現腰、背、手、腳等關節有針刺般痛感，數年后骨骼嚴重畸形，骨脆易折，其原因是該河岸的冶煉廠等排放的含鎘物質污染了水體，當地居民長期飲用鎘污染的河水并食用鎘污染水種植的稻米，使鎘在體內蓄積而中毒致病。2011年2月，國內許多媒體報道，我國一些礦區殘留的重金屬鎘正通過污染土壤侵入稻米，抽樣調查顯示中國多地市場上約10％大米鎘含量超過國家規定的標準，引起了食品衛生部門的高度重視。許多研究證明，鎘對植物體產生毒性的臨界值一般高于動物和人體毒害臨界值，也就是說，重金屬鎘對動物及人體的危害比植物更為嚴重。

許多研究表明，各種海洋動物由于生境和食性的差別，其體內重金屬蓄積的種類有所不同。例如以浮游生物為食的魚類、貝類等體內的砷、鎘的含量較高,?以固著藻類和有機質碎屑為食的魚類和貝類等體內鉻、銅的含量較高，以底棲小型動物為食的魚類和貝類體內鋅的含量較高，雜食性動物體內的鉛、鎳含量高。以上為本發明生物材料的選擇提供了基礎。

目前，世界各國都十分重視重金屬鎘污染的環境檢測，不斷加強對采礦廢料、工業廢水、生活污水的監測和處理，對于農產品和水產品中的有害物也有嚴格的衛生檢測標準、檢測機構和定期監測部門。但是，傳統的幾種檢測手段在靈敏度和穩定性方面有明顯不足，最重要的是傳統方法沒有真正反映出生物體在鎘脅迫下其生理、生化反應及代謝調節作用等方面的變化。本發明是基于重金屬鎘對軟體動物青蛤產生毒害情況下，引起青蛤相關基因應激表達而建立的一種快速、靈敏的水體重金屬鎘的有效監測方法，也可以作為環境監測部門評價水體重金屬鎘對生物產生毒害的早期觀測值。

熱休克蛋白HSP70是一種在幾乎所有生物應激細胞中都存在、并廣泛參與各種保護機體和細胞功能的大分子，其具有穩定新生多肽、幫助蛋白進入內質網和線粒體等重要作用。該蛋白的基因在重金屬脅迫下會大量誘導，以表達出應激性蛋白使機體抵御不良環境。鑒于以上特征，該家族蛋白被認為是水體環境環境監測的重要標志物。使用生物標志物作為監測手段的優點如下；首先，它反映的是生物實際的生理狀態，監測的是個體免疫應激反應的相關指標變化，這種變化通常要早于有害物在水體中蓄積水平的變化，因而能起到早期預測的作用，這也是生物標志物最重要之處。另外，目前國內水體重金屬生物標志物方面的技術僅局限于測量應激蛋白含量及活性。有關利用應激性蛋白基因的表達過程作為重金屬鎘污染監測方法方面，沒有任何正式的相關技術報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有監測技術中利用傳統儀器和生化方法測量的缺點與不足，提供一種快速、靈敏的水體重金屬鎘的高效分子生物學監測方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

一種監測海水中重金屬鎘的熱休克蛋白HSP-70熒光PCR反應的特異性引物，其特征在于：

擴增引物

上游引物為：HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

下游引物為HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

作為內參基因的青蛤β-actin基因特異性上下游引物：