[發(fā)明專利]一種海水中重金屬鎘污染的生物學靈敏檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210316610.3
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102808036A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘寶平;張麗巖;羅凱婭
• 申請（專利權(quán)）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種用于監(jiān)測海水中重金屬鎘污染的熱休克蛋白HSP-70實時熒光定量PCR反應的特異性引物，其特征在于：

上游引物為：HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

下游引物為：HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

作為內(nèi)參基因的青蛤β-actin基因特異性上下游引物為：

β-actin-S：5'-CACCACAACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGACCTGACC-3'。

2.一種采用權(quán)利要求1所述特異性PCR引物檢測海水中重金屬鎘的生物學方法，其特征在于按如下步驟進行；

（1）以青蛤作為用于重金屬鎘污染監(jiān)測的指示生物樣本；

（2）樣本總RNA提取與純化：采用通用的RNA提取方法和純化方法，從青蛤肝臟提取得到純化的肝臟總RNA；

（3）cDNA第一鏈合成：以青蛤肝臟中總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系為25μL；

（4）實時熒光PCR檢測：以上述合成的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)所述的特異性引物和內(nèi)參引物，進行實時熒光PCR擴增反應，獲取各管Ct值（Cycle?threshold指每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）；

實時熒光PCR擴增體系設(shè)置如下：

試劑使用量終濃度SYBR? Premix DimerEraser?（2×）熒光PCR混合物12.5 μl×1PCR Forward Primer（10 μM）正向引物0.75 μl0.3 μM×1PCR Reverse Primer（10 μM）反向引物0.75 μl0.3 μM×1Template（＜100 ng）模板2 μl×2dH₂O 滅菌蒸餾水9 μl?Total? Volume 總體積25 μl×3

實時定量熒光PCR擴增參數(shù)設(shè)置如下；

Hold（初期變性）：Cycle（循環(huán)數(shù)）：1?

95℃?30秒?

3?Step?PCR（擴增）：Cycle（循環(huán)數(shù)）：40?

95℃?5秒?

55℃?30秒?

72℃?30秒?

Dissociation；

（5）青蛤肝臟HSP70基因的相對表達量計算：實時熒光PCR完成后，根據(jù)儀器自動記錄的每管Ct值，使用以下公式計算；

HSP70基因相對表達量=2^-△△Ct；

^?△Ct=Ct?HSP70-Ct?β-actin；

△△Ct=(CtHSP70-Ctβ-actin)實驗組-(CtHSP70-?Ctβ-actin)對照組；

2^-△△Ct計算實驗組模板中HSP70基因的量相對于對照組的變化量，取實驗均值，即為青蛤肝臟HSP70基因的相對表達量。