[發明專利]一種富集水產品中天然四環素類抗生素的方法

有效

• 申請號: 201210315887.4
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN103076415A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 許恒毅;熊勇華;梁語嫣;羅薇;郭亮;徐峰;賴衛華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N30/08
• 分類號: G01N30/08;B01J20/285;B01J20/30
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

????本發明涉及食品安全分析領域，具體是涉及一種以表面修飾有苯酚或苯甲酸功能團的聚苯乙烯磁球富集水產品中天然四環素類抗生素的磁分散固相萃取方法。

背景技術

????四環素類抗生素（Tetracyclines,?TCs）是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，分為天然品（金霉素、土霉素、四環素和強力霉素）與半合成品（多西環素、美它環素、米諾環素和胍哌四環素等）兩類。四環素族的化學結構：

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????四環素、土霉素、金霉素及多西環素因其優良的抗菌性、穩定的藥性及低廉的價格，廣泛應用于水產養殖業中水產疾病的預防、治療和促進生長。但該類藥物的過量使用導致其在可食性動物組織中高濃度殘留，直接影響食用者的健康，并導致人體內細菌耐藥性增加。世界食品法典委員會和世界各國對水產品中四環素族抗生素殘留均有嚴格的限量要求，國際貿易中也對其限量有嚴格規定。目前歐洲已禁止該類抗生素作為促生長抗生素應用，美國和日本仍在使用金霉素和土霉素季胺鹽，我國仍大量使用土霉素鈣鹽。因此世界各國對TCs?殘留的檢測十分關注，我國和歐盟明確規定：牛奶和肌肉組織中?TCs總含量不得超過100?μg/kg，雞蛋中TCs總含量不得超過200?μg/kg；美國食品藥品監督管理局規定：TC、OTC（土霉素）、CTC（金霉素）在動物肌肉組織中總量不得超過2?μg/g，在牛奶中總量不得超過300?ng/g。

高效液相色譜法（High?performance?liquid?chromatography，HPLC），由于具有高效分離及高靈敏度的特點，被廣泛用于動物源性食品中四環素類抗生素的分離檢測。中華人民共和國國家標準（GB/T?21317-2007）使用HPLC法檢測動物源性食品中四環素類獸藥殘留量，其土霉素、金霉素、四環素的方法檢測限為50.0?μg/kg；中華人民共和國水產行業標準（SCT?3015-2002）用HPLC法檢測水產品中四環素類抗生素殘留量，檢測限為：土霉素≤0.05?mg/kg，四環素≤0.05?mg/kg，金霉素≤0.1?mg/kg；中華人民共和國國家標準（GB/T?20764-2006）采用液相色譜-紫外檢測法對可食動物肌肉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量進行測定，該方法檢出限可達0.005?mg/kg。目前儀器法檢測水產品中四環素類抗生素殘留，其樣品前處理均采用固相萃取柱進行樣品濃縮和凈化，柱材料粒徑一般為幾十至幾百微米、材料表面修飾了疏水以及部分親水性基團。固相萃取柱材料裝柱量一般為100至500?mg，過柱速度為每分鐘1至3?mL。

發明內容

傳統的水產品中四環素提取方法多采用液液萃取或固相萃取方法，總體存在提取時間長，溶劑用量大，在痕量藥物殘留時提取回收率偏低等缺陷。

本發明的目的是提供一種靈敏度高、簡便和快速的水產品中天然四環素類抗生素的高效富集和凈化的樣品前處理新方法。包括如下步驟：

（1）在水產品（如魚類、蝦和蟹等）肌肉組織中加入適量0.1?mol/L?pH4.0的乙二胺四乙酸鈉/Mcllvaine緩沖液，樣品經勻漿后，離心至明顯分層，取上清。抽提上清液調整pH至5.0-6.0，溶液中加入一定量苯酚或者苯甲酸功能團修飾的聚苯乙烯磁球（見圖1），充分混勻吸附3-5分鐘，磁力架分離磁球，棄去上清。

（2）1-5%甲醇水溶液洗滌磁球2-3次。

（3）加適量含20%乙腈以及10%甲醇的0.01?mol/L草酸溶液至吸附有四環素類抗生素的磁球中，分離磁球，收集洗脫液。

水產品樣品包括各式新鮮或冷凍加工后的能順利取肉的魚、蝦、蟹等水產品。提取緩沖液用量以能使抗生素充分溶出，并利于后續勻漿為準。為了更充分富集肉中的天然四環素，經提取緩沖液提取過后的沉淀可以再采用0.1mol/L?pH4.0的乙二胺四乙酸鈉/Mcllvaine緩沖液重新提取一次，合并兩次抽提上清，然后進行后續吸附步驟。分離磁球的過程可以采用常規的磁力架分離或者通過離心分離磁球等方法。吸附時，磁球粒徑大，磁球用量相對稍多。

采用本發明方案對天然四環素類抗生素具有優秀的富集效果，加標回收率高，這可能是由于四環素類抗生素含有氫化并四苯疏水母核結構以及多羥基或羰基取代功能團，而吸附劑表面修飾有苯酚或苯甲酸功能團，吸附劑可通過苯環范德華力或疏水作用與四環素抗生素母核結構結合，同時吸附劑上的羥基或羰基功能團與四環素類抗生素羰基或羥基可形成氫鍵相互作用，從而實現對該類抗生素的吸附。