[發明專利]定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝

有效

• 申請號: 201210315550.3
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102786591A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 徐華民;趙榮華;趙艷琨;徐萌
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C07K14/825
• 分類號: C07K14/825;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;A01K67/033
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技術領域

本發明屬于生物工程領域，尤其是涉及一種定向誘導合成金屬硫蛋白及分離純化工藝。

背景技術

金屬硫蛋白是一種含有大量Cd和Zn的蛋白質，廣泛存在于生物體內。金屬硫蛋白相對分子質量6000~10000，富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量結合金屬離子，具有很強的生物活性。

大量研究結果表明，金屬硫蛋白有下列功能：1、清除自由基，拮抗電離輻射；2、參與微量元素的貯存、運輸和代謝；3、重金屬的解毒作用；4、參與激素和發育過程的調節，增強機體對各種應激反應；5、參與細胞DNA的復制和轉錄，蛋白質的合成與分解，以及能量代謝的調節過程。

201110076199.2公開了一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法。生產步驟為：蟲草菌—液體培養—過濾—含金屬硫蛋白菌體—研磨—有機物變性—去雜蛋白—加熱變性—除變性蛋白—超濾濃縮—層析—冷凍干燥成品。

201110063616.X公開了嗜冷紅酵母中金屬硫蛋白的制備工藝，工藝過程為菌株篩選—培養—細胞破壁—凝膠過濾—離子層析—冷凍干燥成品。

200910308720.3?公開了從家蠅幼蟲中誘導并提取金屬硫蛋白的方法。該方法利用富含金屬離子生物誘導劑的培養基加入家蠅幼蟲培育出成蟲，再經漂洗、滅菌、均漿、膜過濾、分離、濃縮、冷凍干燥成品。

01128543.5?公開了液體涂層發酵轉基因工程菌生產人或動物金屬硫蛋白制品的方法。該方法是將轉基因工程菌通過深層發酵、培養工程菌、過濾、洗滌、冷凍干燥成品。

200910309136.X?公開了一種富鋅黃粉蟲的飼養方法，該方法包括幼蟲養殖、富鋅養殖，大齡黃粉蟲用硫酸鋅水溶液飼喂得富鋅黃粉蟲。

200910309135.5?公開了一種富硒黃粉蟲的飼養方法，該方法包括幼蟲養殖、富硒養殖，大齡黃粉蟲用亞硒酸鈉水飼喂，得富硒黃粉蟲。

01131966.6公開了金屬硫蛋白的制備方法，該方法選擇金屬硫蛋白工程菌，接種于培養液，收集菌體，超聲破碎，層析分離，梯度洗脫，收集目標蛋白。

金屬硫蛋白是一種用途廣泛的金屬蛋白物，但是由于來源的局限性，科技人員一直在研究開發產生金屬硫蛋白的原料，產率和效率是一個長期關注的問題。

發明內容

針對現有金屬硫蛋白來源的局限性，本發明提供一種定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：1、選擇合適的原材料配制培養基；2、培養基二次發酵復制；3、九龍蟲蟲卵培殖；4、九龍蟲蟲卵植入復制培養基中；5、超聲波振蕩培育；6、九龍蟲成蟲處理；7、微濾與超濾；8、超聲駐波液相制備色譜分離純化；9、冷凍干燥至成品；具體步驟如下：

（1）選擇合適的原材料配制培養基，所述培養基由1000g麥麩或米糠、50~200g大豆豆粉、0~20g賴氨酸、0~20g甘氨酸、10~80g胱氨酸、10~20gCuSO₄、5~20gNaCl、0~20gCdSO₄、0~10gCaSO₄、0~20gZnSO₄混合而成；

（2）上述培養基噴淋去離子水，保持溫度25~45℃，時間48~120h，使培養基充分發酵；

（3）將九龍蟲雄蟲與雌蟲按2：3比例混合，保持溫度25~30℃，濕度60~85%，雄蟲與雌蟲交配5~7天產卵，蟲卵在8~12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；

（4）將5~8g幼蟲置于前述的發酵培養基中，保持溫度20~30℃、濕度60~85%培養，待幼蟲第一次脫皮后超聲波振蕩培育；

（5）待幼蟲脫皮6次后的第4~6天，收集九龍蟲幼蟲，用去離子水清洗，甩干九龍蟲幼蟲表面水分；

（6）甩干的九龍蟲幼蟲搗碎，加熱80~100℃，時間5~10min，離心分離，收集分離液；

（7）分離液進行微濾與超濾處理，收集濃縮液；

（8）100mL濃縮液溶于1000~2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相制備色譜里連續分離純化金屬硫蛋白；

（9）將分離純化的金屬硫蛋白冷凍干燥至成品。