[發明專利]一種精制谷胱甘肽發酵液的方法

無效

• 申請號: 201210313822.6
• 申請日: 2012-08-20
• 公開（公告）號: CN102827244A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 陳健輝;朱義福;饒漢生;江燕斌;馬建;鄭凝堅
• 申請（專利權）人: 廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司;華南理工大學
• 主分類號: C07K5/037
• 分類號: C07K5/037;C07K1/16
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 羅曉林

技術領域

本發明涉及谷胱甘肽的分離純化，特別是涉及用制備型液相色譜精制谷胱甘肽發酵液的方法，屬于分離純化技術領域。

背景技術

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，即γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成具有重要生理功能的活性三肽。它主要以還原態(GSH)和氧化態(GSSH)兩種形態存在，其中在機體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽。GSH在臨床、保健產業、食品、飼料等領域有著極其廣泛的應用。隨著近年來人們對保健養生的逐漸重視，GSH的需求量逐年上升。目前，谷胱甘肽的生產方法主要有溶劑萃取法、化學合成法、酶法和發酵法。其中發酵法是最具潛力的方法，已經成為國內外生產GSH最普遍的方法。國內采用發酵法生產谷胱甘肽的瓶頸主要在于發酵水平低下，后續提純工藝收率低，產品純度低、質量差、成本高，遠達不到醫藥級GSH的質量要求。

色譜是迄今為止人類掌握的對復雜混合物分離效率最高的一種方法。當混合物中各組分的化學或物理性質十分接近時，用其它分離技術很難使其分離，此時色譜技術就能顯示出其實際有效的優越性。經典柱色譜法雖然可以處理大量樣品，但效率低下，分離周期長，溶劑消耗量大。而現代制備色譜法則具有柱效高，分離速度快等特點，是分離純化天然產物與化學合成產物的極好技術手段。制備色譜研究的核心，是色譜過程的放大。盡管制備色譜的模型與分析色譜的模型相似，但是制備色譜并非分析色譜簡單的放大，二者有著許多的不同。分析色譜是在最短時間內得到最大的分離效率，并且需要全面的反應樣品組成信息，不必收集特定組分，洗脫液直接棄掉；制備色譜則是在保持最低分辨率的前提下，使柱子超載以獲得最大物料通過量，需對其洗脫液進行收集，從而可以在最短時間內得到更多的純組分，其主要考慮因素是目標產物的純度、產量、周期、運行成本等。

制備型液相色譜屬于非線型色譜，利用制備型液相色譜可以獲得一定純度的產品。與分析型液相色譜相比，制備型液相色譜的進樣量遠大于分析型液相色譜，其色譜峰峰型不對稱，且峰的保留時間隨樣品量的大小變化而變化，色譜峰的高度與樣品量的大小不呈正比例關系。與其他制備方法相比，液相色譜是目前技術最成熟、應用最廣泛的一種。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術存在的不足，利用制備型液相色譜，提供一種對谷胱甘肽粗品進行精制的方法，使谷胱甘肽粗品中GSH純度從45％～55％提高到85％以上。

本發明用的制備型液相色譜法，是一種基于組分在柱填料和洗脫液中分配系數的差異，當兩者作相對運動時，樣品中的不同組分將會形成不同遷移速度的譜帶而實現分離的新型高效分離技術。該法已經廣泛的用于各種高純度生物活性物質的制備，適合對谷胱甘肽粗品的精制。

為達到精制谷胱甘肽的目的，本發明采取的技術方案為：

一種利用制備型液相色譜精制谷胱甘肽發酵液的方法，包括以下步驟：

(1)樣品的預處理：對發酵菌種經過破壁處理得到的谷胱甘肽抽提液進行離心，并對離心液進行超濾處理，以除去其中的大顆粒雜質。再用大孔吸附樹脂對其初步純化處理得預洗脫液，收集并濃縮預洗脫液得到谷胱甘肽粗品；

(2)調節粗品pH：用0.1mol/L的鹽酸溶液調節步驟(1)所得的谷胱甘肽粗品的pH值為3.0～3.5；

(3)參數設置和進樣：設置制備液相色譜的操作參數，掃描波長為210±10nm，掃描時間為60±5min，同時對流動相流速及流動相組分進行設定，基線水平后進樣，經制備型液相色譜分離后得洗脫液；

(4)收集洗脫液：當響應值大于100mAU后開始收集流出液，并對每個響應峰分別收集。用亞硝基鐵氰化鉀法對收集液進行定性判斷，收集谷胱甘肽高峰液，以質量分數計，純度在85％以上。

進一步地，經過預處理后得到的谷胱甘肽樣品濃度優選為5g/L-10g/L。

以質量百分比計，經過預處理后得到的谷胱甘肽樣品純度為45％～55％。

步驟(3)中，所用的流動相優選甲醇溶液，其濃度為5％～10％。

步驟(3)中，所用流動相流速為3mL/min～5mL/min。

步驟(4)中，收集谷胱甘肽高峰液區域為13min～20min。

相對于現有技術，本發明精制谷胱甘肽粗品的方法具有以下有益效果：

(1)本發明所用制備型液相色譜具有較高的分離效率，處理量大，能實現自動化操作等優點。