[發明專利]草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201210312755.6
• 申請日: 2012-08-29
• 公開（公告）號: CN102998457A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 周紅;陳丹燕;張安英
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 溫利平

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及酶聯免疫檢測（ELISA）生物技術領域。

背景技術

腫瘤壞死因子alpha（tumor?necrosis?factor-alpha,TNF-α）是一種重要的細胞因子。早在30多年前，Carswell等人發現了一種存在于血清中，能抑制和殺傷某些腫瘤細胞，并使體內腫瘤發生出血壞死的蛋白物質，被命名為腫瘤壞死因子(tumor?necrosis?factor,TNF)。研究發現，腫瘤壞死因子alpha參與和調控機體的免疫功能和炎癥反應，發揮促進細胞生長、分化、凋亡等重要作用。自從牙鲆中克隆出第一個腫瘤壞死因子alpha基因的全長cDNA序列開始,腫瘤壞死因子alpha在魚類中的研究開始受到重視，研究表明魚類腫瘤壞死因子alpha表現出極大的功能差異說明其功能具有種屬特異性，因此有必要對草魚腫瘤壞死因子alpha在草魚中的功能檢測和應用進行研究。

草魚（Ctenopharyngodon?idellus）屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，英文名：Grass?carp，是中國淡水養殖的四大家魚之一，具有重要的經濟價值。但草魚抗病力和成活率較低，易患出血病、爛鰓病、赤皮病和腸炎病等。加之高密度養殖增加了水產動物之間病原體交叉感染的機會，使病害日益加劇，因此研究草魚免疫系統的各類免疫反應及其調節機制十分重要。由于腫瘤壞死因子alpha在魚類炎癥反應中具有廣泛生物學活性及其在免疫調控中的重要性，因此檢測腫瘤壞死因子α在草魚中的功能對草魚免疫系統的研究以及魚類疾病的治療密切相關。同時，由于魚類腫瘤壞死因子alpha與哺乳動物和兩棲動物的腫瘤壞死因子α分子在結構和功能方面存在較大差距，不能用其他種族的腫瘤壞死因子alpha蛋白和抗體代替魚類腫瘤壞死因子alpha進行研究，加之魚類腫瘤壞死因子alpha抗體的缺乏使對腫瘤壞死因子alpha功能地位的研究陷入瓶頸。目前尚沒有專門檢測草魚腫瘤壞死因子alpha濃度的酶聯免疫反應方法。

發明內容

本發明的目的針對現有檢測草魚腫瘤壞死因子alpha濃度方法的不足，通過重組草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白制備多克隆抗體，并成功建立草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，為研究腫瘤壞死因子alpha的功能提供了基礎方法。

本發明的技術方案是：草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1：確定包被抗原的濃度和多克隆抗體的最適稀釋倍數；

步驟2：建立競爭抑制酶聯免疫檢測方法，具體過程包括如下步驟：

步驟21：包被草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白的酶標板得到固定于酶標板上的抗原；

步驟22：封閉去除酶標板上沒有包被上草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白的部位；

步驟23：制備酶標抗體與抗原混合液；

步驟24：將酶標抗體與抗原混合液混合后與固定于酶標板上的抗原競爭結合；

步驟25：洗滌酶標板以及對底物顯色；

步驟26：對酶標板的孔進行讀數得到每個孔的吸光值（OD），根據讀取的吸光值分別計算標準品抗原和待測樣品的抑制率從而根據該抑制率計算待測樣品的濃度。

本發明的有益效果是：以重組草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白作為包被抗原，采用多克隆抗體，建立了草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白檢測競爭抑制酶聯免疫檢測方法，為檢測草魚中腫瘤壞死因子alpha的蛋白表達水平提供了快速高效的檢測手段，該法穩定可靠，且成本較低。

附圖說明

圖1是草魚腫瘤壞死因子alpha?ELISA檢測的標準曲線。

圖2是采用本發明的方法檢測草魚頭腎白細胞中腫瘤壞死因子alpha蛋白的分泌結果。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步的說明。

一種草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，利用重組草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白作為免疫原免疫健康的新西蘭大白兔得到多克隆抗體（草魚腫瘤壞死因子alpha多克隆抗體），再用辣根過氧化物酶（HRP）標記該多克隆抗體得到HRP標記草魚腫瘤壞死因子alpha多克隆抗體（以下簡稱酶標抗體）。最后再次采用重組草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白作為包被抗原和酶標抗體從而建立草魚腫瘤壞死因子alpha（TNFα）的競爭抑制酶聯免疫（ELISA）檢測方法。