[發明專利]草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201210312755.6
• 申請日: 2012-08-29
• 公開（公告）號: CN102998457A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 周紅;陳丹燕;張安英
• 申請（專利權）人: 電子科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 溫利平

1.草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1：確定包被抗原的濃度和多克隆抗體的最適稀釋倍數；

步驟2：建立競爭抑制酶聯免疫檢測方法，具體過程包括如下步驟：

步驟21：包被草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白的酶標板得到固定于酶標板上的抗原；

步驟22：封閉去除酶標板上沒有包被上草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白的部位；

步驟23：制備酶標抗體與抗原混合液；

步驟24：將酶標抗體與抗原混合液混合后與固定于酶標板上的抗原競爭結合；

步驟25：洗滌酶標板以及對底物顯色；

步驟26：對酶標板的孔進行讀數得到每個孔的吸光值（OD），根據讀取的吸光值分別計算標準品抗原和待測樣品的抑制率從而根據該抑制率計算待測樣品的濃度。

2.根據權利要求1所述的草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，步驟1中經過棋盤滴定法確定競爭抑制酶聯免疫檢測時酶標抗體的最適稀釋倍數為1：2000，包被抗原濃度為2μg/ml，每孔滴加100μL。

3.根據權利要求1所述的草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，步驟21中，具體操作過程為用抗原稀釋液（pH為9.6的0.05M（mol/L）碳酸鹽緩沖液）稀釋草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白（2μg/ml/孔）成為包被液，用包被液包被96孔酶標板，每孔加入包被液體積為100μl；4℃條件下包被過夜后甩干，用洗滌液（pH為7.4的0.1M磷酸鹽緩沖液中含0.05%Tween-20，PBST）洗滌三次（每次300μl/孔），每次3分鐘。

4.根據權利要求1所述的草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，步驟22中，用封閉液（pH為7.4的0.1M?PBS稀釋5%脫脂奶粉、0.3%牛血清白蛋白溶液）室溫封閉2小時，每孔加封閉液300μl。

5.根據權利要求1所述的草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，步驟23中，用抗原/抗體稀釋液（PBST）將重組草魚腫瘤壞死因子alpha蛋白稀釋到如下濃度：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml以及20ng/ml作為不同濃度標準品，取不同濃度標準品50μl與50μl酶標抗體（PBST溶液中按1：2000比例稀釋）混勻后室溫孵育2小時。對待測樣品的檢測：取待測樣品50μl與50μl?1:2000稀釋的酶標抗體混合，同樣室溫孵育2小時。

6.根據權利要求1所述的草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，步驟24中，酶標板中抗原完成封閉后，甩干封閉液，并用300μl?PBST洗滌三次，每次至少3分鐘，然后加入步驟23中制備完成的酶標抗體與抗原混合液，每孔中加入酶標抗體與抗原混合液100μl，室溫孵育至少2小時。

7.根據權利要求1所述的草魚腫瘤壞死因子alpha的競爭抑制酶聯免疫檢測方法，其特征在于，步驟25中，待步驟24結束后，甩干孔內液體，用300μlPBST洗滌五次，每次3分鐘，然后每孔加入100l?TMB底物，37℃反應20分鐘后加入50μl2M硫酸（H₂SO₄）終止反應。