[發(fā)明專利]CRP單克隆抗體納米乳膠微球組合物及制備工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210311219.4
• 申請日: 2012-08-29
• 公開（公告）號: CN103073642A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王雷;李一凡
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳伯美生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K17/08;G01N33/68
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫領(lǐng)域，涉及C反應(yīng)蛋白(C-reactive?protein,CRP)單克隆抗體(Monoclonal?antibody，McAb)的制備，涉及C反應(yīng)蛋白單克隆抗體納米乳膠微球的偶聯(lián)，涉及不同C反應(yīng)蛋白抗體納米乳膠微球偶聯(lián)物的組合，還涉及C反應(yīng)蛋白的檢測應(yīng)用。?

背景技術(shù)

C反應(yīng)蛋白是可在急性炎癥病人血清中濃度升高的可以結(jié)合肺炎球菌細(xì)胞壁C多糖的蛋白質(zhì)。人類C反應(yīng)蛋白至少可以有兩種存在形式，一種是由五個相同的亞基以非共價鍵形成五聚體(pentameric?CRP，pCRP)，這是血清中CRP主要存在形式；另一種為單個亞基的單體(modified/monomeric?CRP，mCRP)，可由五聚體在活化的血小板膜上分解形成。作為一種急性時相反應(yīng)蛋白，血漿中CRP濃度在正常人中含量極微，一般新生兒血清CRP水平小于2mg/L，兒童和成人小于10mg/L，但在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫癌浸潤時迅速顯著的增高，可達(dá)正常水平數(shù)百倍甚至上千倍。CRP上升速度、幅度和持續(xù)時間與病情和組織損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此作為炎癥和組織損傷的非特異性標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷和風(fēng)險評估。?

CRP濃度的臨床檢測方法主要有膠乳凝集法、免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法及乳膠增強(qiáng)比濁法等，其中乳膠增強(qiáng)比濁法是目前公認(rèn)檢測效率最高的方法。CRP檢測按其濃度檢測范圍大致分為兩類：第一類是普通CRP檢測，檢測范圍通常在3-200mg/L，但其線性范圍不能覆蓋微量CRP。第二類是高敏CRP(high-sensitivity?CRP，hs-CRP)檢測，它比常規(guī)檢測方法更敏感，靈敏度可低于0.3mg/L，能準(zhǔn)確定量0.1~10mg/L濃度范圍內(nèi)的CRP，臨床上用于評估心臟病發(fā)病風(fēng)險，但是高敏CRP試劑無法檢測更高濃度的CRP。?

目前在國內(nèi)用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定CRP的試劑盒中，其致敏乳膠微球的抗體大多為CRP多克隆抗體(Polyclonal?antibody，PcAb)，或是采用兩種粒徑微球分別偶聯(lián)CRP多克隆抗體后混合作為反應(yīng)試劑。這些試劑盒有以下不足：首先，雖然多克隆抗體乳膠微球比單克隆抗體乳膠微球具有更高的靈敏度，但線性范圍較窄，單獨(dú)使用不易達(dá)到CRP全程測量的要求；其次，單一粒徑的微球偶?聯(lián)CRP多克隆抗體制備乳膠微球增強(qiáng)免疫比濁試劑，無法同時測定高濃度和低濃度水平下的CRP含量。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)上的不足，提供多株互補(bǔ)配對的CRP單克隆抗體及多克隆抗體，并與納米乳膠微球偶聯(lián)，偶聯(lián)物按比例混合制成組合物，應(yīng)用于CRP免疫定量試劑盒的制備，可與全自動生化分析儀、特種蛋白分析儀等儀器匹配進(jìn)行免疫透射和免疫散射比濁測定人全血、血清CRP濃度，實(shí)現(xiàn)CRP全量程檢測。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：選擇高親和力的CRP單克隆抗體的多株互補(bǔ)配對亞型，用特殊工藝分別與合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球偶聯(lián)，制成CRP單克隆抗體納米乳膠微球偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物可按不同的比例與CRP多克隆抗體乳膠微球偶聯(lián)物混合，從而提高CRP檢測的性能指標(biāo)。?

本發(fā)明可應(yīng)用于免疫比濁法（散射免疫/透射免疫比濁）測定人血CRP濃度。?

本發(fā)明的具體步驟如下：?

1，從人血清純化天然CRP作為免疫原，制備高特異性、高親和力、高純度的CRP單克隆抗體。?

2，選擇合適粒徑的羧基化聚苯乙烯微球，通過1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide?hydrochloride,EDAC)活化微球表面的羧基，生成活性酯，再與CRP單克隆抗體上的伯胺基反應(yīng)，形成共價鍵，完成交聯(lián)，獲得CRP單克隆抗體乳膠微球偶聯(lián)物。?

3，選擇合適的儲存液懸浮CRP單克隆抗體乳膠微球偶聯(lián)物，或?qū)⒉煌珻RP抗體乳膠微球偶聯(lián)物按一定比例混合，配制成適合CRP檢測的試劑，使其同時滿足高靈敏度和寬線性范圍的要求，用于臨床上乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測CRP濃度。?