[發明專利]用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備和顯微鏡方法

有效

• 申請號: 201210309874.6
• 申請日: 2012-08-28
• 公開（公告）號: CN102981260A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 馬庫斯·蒂壩
• 申請（專利權）人: 萊卡微系統CMS有限責任公司
• 主分類號: G02B21/36
• 分類號: G02B21/36
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 張大威

技術領域

本發明涉及用于點狀物體的三維定位的顯微鏡設備和顯微鏡方法。

背景技術

光學顯微成像方法最近已被發展，該光學顯微成像方法使得成像比通過采用單獨標記(特別是熒光分子)的連續的、隨機的定位的常規光學顯微鏡的衍射誘導的分辨率極限更小的樣本結構成為可能。例如在WO?2006/127692?A2，DE?10?2006?021?317?B3，WO?2007/128434A1，U.S.2009/0134342?A1，DE?10?2008?024?568?A1，WO?2008/091296?A2，“Sub-diffraction-limit?imaging?by?stochastic?optical?reconstruction?microscopy(STORM)，”Nature?Methods?3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution?of?Lambda/10?in?fluorescence?microscopy?using?fast?single?molecule?photo-switching，”Geisler?C.等，Appl.Phys.A，88，223-226(2007)中描述了這樣的方法。顯微術的這個新的分支也被稱為定位顯微術。應用的方法在文獻中例如通過以下名稱是已知的：(F)PALM((熒光)光活化定位顯微術((fluorescence)photoactivation?localization?microscopy))，PALMIRA(具有獨立地運行采集的PALM(PALM?with?independently?running?acquisition))，GSD(IM)(基態損耗(單獨分子返回)顯微術(ground?state?depletion(individual?molecule?return?microscopy)))或(F)STORM((熒光)隨機的光學重建顯微術((fluorescence)stochastic?optical?reconstruction?microscopy))。

這些新方法的共同之處是：待成像的樣本結構的準備包括使用點狀物體，點狀物體通常被稱為標記，點狀物體具有兩個可分辨的狀態，即“明亮”狀態和“黑暗”狀態。例如，如果熒光染料被用做標記，則該明亮狀態為能夠發熒光的狀態，且該黑暗狀態為不能發熒光的狀態。

在優選的特定實施例中，例如，在WO?2008/091296?A2和WO?2006/127692?A2中，使用了可光切換的(photoswitchable)或可光激活的(photoactivatable)熒光分子。可選地，如，例如，在德國審查的接受的說明書DE?10?2006?021?317?B3中的，利用標準熒光分子的固有黑暗狀態。

為了以比成像光學部件的常規分辨率極限更高的分辨率使樣本結構成像，標記中的小子集被重復地轉換到明亮狀態。這需要選擇形成這個激活的子集的標記的密度，該密度將確保在明亮狀態(因此在該狀態下可通過光學顯微術成像)中相鄰的標記之間的平均距離大于成像光學部件的分辨率極限。形成激活的子集的標記被成像到空間分辨的光檢測器(例如，CCD照相機)上，以便從每個點狀標記記錄以光斑為形式的光分布，通過光學部件的分辨率極限確定光斑的尺寸。

因此，在其他激活子集被成像中的每一個中，多數單獨的原始數據圖像被捕獲。在每個單獨的原始數據圖像中，然后可在圖像分析步驟中確定光分布的質心位置，該光分布表示在明亮狀態中的點狀標記。然后將從單獨的原始數據圖像中確定的光分布的質心位置以組合的圖像數據記錄的形式的全部表現而集合。由這個全部表現產生的高度分辨的組合圖像反映標記的分布。

典型地復制待成像的樣本結構需要足夠數量的標記信號被檢測。然而，由于在特定激活子集中標記的數量受在明亮狀態中的兩個標記之間的所需的最小平均相互距離限制，因此必須記錄大量的單獨的原始數據圖像以能夠完全地成像該樣本結構。單獨的原始數據圖像的數量范圍典型地為10000至100000。

在以上描述的定位顯微術方法中，在光檢測器上生成的單獨的光斑的質心位置典型地僅在二維上確定，以便從所有質心位置重建的樣本結構的高分辨圖像同樣地也僅是二維圖像。然而，在三維上重建該樣本結構是優選的。