[發(fā)明專利]昆蟲細胞系的建立方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210309763.5
• 申請日: 2012-08-28
• 公開（公告）號: CN102776149A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設計）人: 馮穎;張欣;丁偉峰;李嫻;馬濤;孫龍;何釗
• 申請（專利權）人: 中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12R1/91
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

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技術領域

本發(fā)明涉及一種昆蟲細胞系的建立方法，屬于昆蟲細胞培養(yǎng)技術領域。

背景技術

隨著生命科學的迅猛發(fā)展，作為細胞工程之一的昆蟲細胞培養(yǎng)技術越來越受到國內外學者的重視。作為現(xiàn)代生物學上極有價值的手段之一，昆蟲細胞培養(yǎng)被廣泛地應用于醫(yī)學、遺傳學、分子生物學、生物學、生理學、病毒學、昆蟲病理學及農業(yè)生產等多個領域。1915年，Richard?Goldschedt首次在體外維持了昆蟲組織外植體的活性。1962年，Grace成功地建立起世界上第一個昆蟲細胞系——桉蠶蛾（Anteraea?evcalypti）卵巢細胞系。在以后的幾十年中，昆蟲細胞培養(yǎng)成為世界上許多科學家研究的對象，特別是自Smith創(chuàng)建了昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)（Baculovirus?Expression?Vector?System，BEVS）以來，昆蟲桿狀病毒作為一種安全有效的載體，能在體外培養(yǎng)的昆蟲細胞中高效地表達外源基因，促進了昆蟲細胞培養(yǎng)的發(fā)展。近五十年來，由于昆蟲細胞大規(guī)模培養(yǎng)，使昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)、生物殺蟲劑、抗菌肽等的研究取得了進一步發(fā)展。昆蟲細胞作為昆蟲生理生化研究、生物反應器以及表達基因產物等的重要研究工具，已受到越來越多的重視，不斷有新的昆蟲細胞系建立的報道。到目前為止，全世界建立的昆蟲細胞系有800株以上，分別來源于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8個目的170多種昆蟲，然而其中的大部分均來自鱗翅目和雙翅目，而來源于其他目的昆蟲細胞系僅占1/10左右。我國已先后從鱗翅目、雙翅目的十多種昆蟲中得到了40多個細胞系，與國際的差距較大。相對于龐大的昆蟲種類及昆蟲細胞的廣泛利用領域來說，昆蟲細胞培養(yǎng)及昆蟲細胞系建立的研究仍是一個值得廣泛研究和深入發(fā)展的領域。相對于哺乳動物細胞培養(yǎng)研究的歷史和現(xiàn)狀，昆蟲細胞培養(yǎng)技術仍然處于初始階段，難點和問題很多，許多基本的技術和方法有待建立，需要作大量細致的研究工作。由于昆蟲種類繁多，不同物種、甚至相同物種不同組織來源的細胞培養(yǎng)的方法、現(xiàn)象、規(guī)律往往大不相同。一些研究思路可以借鑒哺乳動物細胞培養(yǎng)的研究，但是也要注重昆蟲細胞自身的特殊性。盡管現(xiàn)有的昆蟲細胞系建立技術已經(jīng)在多種昆蟲種類中得到應用，但是，昆蟲細胞系建立的成功率仍然較低，建系困難且耗時是首要限制因素。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種昆蟲細胞系的建立方法，為昆蟲生理生化研究、生物反應器以及表達基因產物等，提供技術支持和保障。

本發(fā)明通過下列技術方案完成：一種昆蟲細胞系的建立方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟：

1）用質量濃度為65～80%的酒精溶液，對昆蟲蟲體進行滅菌處理1～5min，用無菌水洗2～4次，用濾紙吸去水份；

2）在顯微鏡下挑取步驟1）的昆蟲放入PBS溶液進行常規(guī)清洗；

3）將步驟2）的清洗昆蟲轉入裝有質量濃度為0.10～0.25%的胰酶溶液的1.5～2ml離心管中，將昆蟲剪碎至0.5～1mm³，消化處理5～10min，得昆蟲細胞懸液；

4）將步驟3）的細胞懸液吸入12.5～25cm²的培養(yǎng)瓶中，每瓶裝入量為0.5～1ml，用改良培養(yǎng)基補足至4～5ml，所述每1000毫升改良培養(yǎng)基中含有下列組分：

Grace培養(yǎng)基?????????????40～50g

海藻糖??????????????????0.5～3g

酵母抽提物???????????????0.5～3g

胎牛血清??????????????100～200ml

水??????????????????????????余量；

5）將步驟4）的裝有細胞懸液及改良培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，置于25～28℃的培養(yǎng)箱中，密閉無光照培養(yǎng)至細胞增殖并生長至鋪滿甁底；

（6）將步驟5）的鋪滿甁底的細胞進行常規(guī)懸浮并混勻后，以2:1或3:1的比例分瓶，并加入新鮮的改良培養(yǎng)基補充至4～5ml，繼續(xù)在密閉無光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至細胞增殖，如此傳代培養(yǎng)至50代，使昆蟲細胞系建立。

所述步驟4）的改良培養(yǎng)基中的Grace培養(yǎng)基為市購產品；海藻糖為市購的海藻糖Glucose產品；酵母抽提物為市購的酵母抽提物TC-Yeastolate產品；胎牛血清為市購的滅活胎牛血清，水為純凈水。