[發(fā)明專利]環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210309675.5
• 申請日: 2012-08-28
• 公開（公告）號: CN103623796A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 翁文;亢珊珊;姚碧霞;曾小玲
• 申請（專利權）人: 翁文;漳州師范學院
• 主分類號: B01J20/29
• 分類號: B01J20/29;B01J20/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相的制備方法，具體地說是以三氯聚氰作為交聯劑，將人血清白蛋白交聯到環(huán)糊精鍵合球形硅膠上，得到環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相。

背景技術

手性是生命過程的基本特征，構成生命體的基本物質如蛋白質、多糖和核酸等都具有手性。手性化合物的兩個對映體呈鏡像異構，性質卻不同甚至完全相反，如手性藥物，其對映體在藥理活性、代謝過程、代謝速率以及毒性等方面存在明顯差異。所以，手性化合物越來越受到人們的重視，特別是對手性藥物進行快速分離和測定，已成為研究者們關注的熱點。

目前已經出現了很多的手性藥物分離技術：氣相色譜法（GC）、毛細管電泳法（CE）、超臨界流體色譜法（SFC）等。但是，高效液相色譜（HPLC）法由于對各種分析物具有通用性、靈活性，且操作較簡便，是最常見的應用技術。

?環(huán)糊精因其特殊的分子結構而具有良好的手性識別性能，使之廣泛應用于手性化合物的拆分，但其包合客體分子的范圍有限、溶解度較低等問題使它的應用產生一定的局限性。為了改變環(huán)糊精的這種特性，加強環(huán)糊精的拆分能力，擴大其應用范圍，人們用不同方法對它進行改性，在一定程度上改善了環(huán)糊精的理化性能，使其具有更好的包合選擇性，在各個領域的應用更具優(yōu)越性。

?蛋白質是一類天然的高分子聚合物，結構復雜，具有獨特的三維結構，是對映異構體的天然識別體。蛋白質的這種獨特的立體選擇性，使其成為高效液相色譜分離中最具吸引力的手性固定相之一，在手性藥物的拆分中發(fā)揮著重要的作用。但其也存在很多不足，如：穩(wěn)定性差、柱容量和柱效低等。蛋白質本身固有的性質，如不適于高溫、有機溶劑以及過酸或過堿等，也限制了它的應用范圍。蛋白質通過交聯劑與環(huán)糊精復合后，將大大改善其不足，環(huán)糊精具有穩(wěn)定化作用，可以提高蛋白質的熱穩(wěn)定性以及酸堿穩(wěn)定性等。

?人血清白蛋白(HSA)是最常使用的血清蛋白之一，它具有類似雪茄形狀的分子外形，其相對分子質量大約為66500，是由685個殘基組成的單純蛋白質，單條多肽鏈由大約17個二硫鍵交叉連接，使整個肽鏈折疊成3個相似的區(qū)域，每個區(qū)域又由3個相似的環(huán)組成，每分子只含有一個游離硫氫基。HSA曾被固載在硅膠上用于手性分離。

?環(huán)糊精和蛋白質復合手性固定相的合成與研究具有重要意義，它結合了環(huán)糊精和蛋白質的獨特性質，從而提高了手性固定相的選擇性和穩(wěn)定性。該復合固定相增加了手性識別位點，蛋白質的穩(wěn)定性大大增強，可提高色譜柱的使用壽命。

發(fā)明內容

?本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、具有良好應用前景的環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相的制備方法，以提高手性固定相的選擇性和穩(wěn)定性，特別適用于在親水液相色譜模式下分離強極性化合物。

?為實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案為：首先制備環(huán)糊精鍵合球形硅膠，然后以三氯聚氰作為交聯劑，將人血清白蛋白鍵合到環(huán)糊精鍵合球形硅膠上，得到環(huán)糊精/人血清白蛋白復合的手性固定相。本發(fā)明所提供的鍵合反應選擇性高，反應條件溫和，操作簡便，所制備的環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相手性識別位點增多，并使蛋白質的穩(wěn)定性得到提高，特別適用于在親水液相色譜模式下分離強極性化合物。

?具體制備步驟如下：1).環(huán)糊精鍵合球形硅膠的制備：環(huán)糊精和氫化鈉于有機溶劑中反應1~3h后，過濾，濾液置于燒瓶中，氮氣保護下加入硅烷偶聯劑，100~120℃下反應3~6h，加入活化硅膠，繼續(xù)反應20~25h。反應液冷卻后用G5砂芯漏斗過濾，并依次用DMF、甲醇、二次蒸餾水、丙酮洗滌，所得固體產物50℃真空干燥10~15h，即得環(huán)糊精鍵合球形硅膠。

?步驟1）所用硅烷偶聯劑為KH-560，所用的環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精，所用的球形硅膠是全多孔硅膠小球，粒徑為5~40微米，孔徑為60~300埃。

?步驟1）中環(huán)糊精，氫化鈉，硅烷偶聯劑的摩爾比為1:1:1，所用的有機溶劑為N,N-二甲基甲酰胺，每克硅膠所需有機溶劑的量為10~30mL。

?2).?環(huán)糊精鍵合球形硅膠與交聯劑反應：將步驟1)中所得環(huán)糊精鍵合球形硅膠與交聯劑在冰水浴條件下反應2~5小時后，過濾，丙酮洗滌,真空干燥。

?步驟2）中所用的交聯劑為三氯聚氰，所用的有機溶劑為丙酮。

?3).環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相的制備：將步驟2)中所得產品與人血清白蛋白的磷酸緩沖鹽溶液在20?~40℃下反應2~5小時后，將產物抽濾洗滌，即得到環(huán)糊精/人血清白蛋白復合手性固定相。