[發明專利]復雜天然產物中活性成分篩選方法及應用

有效

• 申請號: 201210307022.3
• 申請日: 2012-08-27
• 公開（公告）號: CN102818868A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 程翼宇;王毅;張玉峰
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬天然藥物篩選領域，具體地說是涉及一種從中藥及天然產物等復雜天然產物中快速分離制備、分析和活性評價的一體化方法，用于復雜天然產物中活性化合物的篩選。

背景技術

天然產物中含有豐富的具有生物活性的成分，是開發新藥候選化合物的巨大資源庫。但是目前針對天然藥物的開發并沒有形成如化學藥物開發那樣的規模，其中最大的技術難度在于天然產物的分離制備與高通量篩選的樣品要求之間存在差距。常規的植化方法大都采用有機溶劑對天然產物進行系統分離，制得的樣品需要干燥、稱量、溶解、配制、加樣等一系列步驟后才能在微孔板中進行高通量篩選，存在耗時耗力等問題。因此，開發一種快速分離制備與活性評價緊密結合的系統可以極大地提高天然藥物中活性化合物發現的速度。

目前，國內外針對天然產物中活性化合物的快速篩選發現已提出了幾種研究思路，如構建多通道逆流色譜與高通量分餾相結合構建的自動化組分制備系統，已應用于一些中藥復方的組分快速制備；又如應用液相色譜與傅里葉變換質譜聯用，結合微孔板分光光度計來篩選柴胡疏肝散中的抗氧化活性成分。這些分離篩選方法，可以提高天然產物中活性成分篩選效率，降低實驗成本和時間。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種復雜天然產物中活性成分篩選方法，是一種在復雜天然產物中通過并行分離制備、分析篩選活性成分的方法，通過以下步驟實現：?

（1）樣品并行制備

將待測樣品（天然產物提取物、中藥提取物或含多種化學成分的混合物樣品）配制成溶液，分別取10-50μL溶液，通過自動進樣器或手動進樣器注入并行制備系統，并行制備系統由二元液相色譜泵，5根并行連接的色譜柱以及4臺餾分收集儀組成（可根據需求擴展），將其中4根色譜柱的洗脫液，采用4臺自動餾分收集儀分別收集至4塊微孔板，每孔中餾分體積根據微孔板容積確定。

（2）樣品分析

　　將上述并行制備系統中剩余1根色譜柱的洗脫液通過管線與紫外/可見光檢測器相連，然后再接入電噴霧－質譜儀，對步驟(1)制備的樣品進行定性分析。

（3）樣品處理

　　通過常規離心濃縮等方法，揮干4塊收集有相同餾分的微孔板中的溶液，再加入一定量溶劑溶解后，作為活性評價的待測樣品。

（4）活性評價

　　在微孔板上，采用基于細胞、酶或者化學反應的活性評價方法對微孔板中各孔對應的餾分的活性進行評價，發現其中具有顯著活性的餾分。基于細胞的活性評價方法包括腫瘤細胞的細胞活力測試、損傷的內皮細胞及心肌細胞活力測試等，可用于評價餾分的抗腫瘤、內皮保護及心肌保護活性。基于酶的活性評價方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶等酶活力測試，可用于評價餾分的酶抑制活性；基于化學反應的活性評價方法包括自由基清除活力測試，可用于評價餾分的抗氧化活性。

（5）活性成分篩選

綜合處理液相色譜－質譜聯用分析數據和活性評價數據，確定活性餾分在液相色譜－質譜聯用分析圖譜中的位置，并進一步提取與該餾分相對應的化合物的紫外光譜、分子量、分子碎片等化學信息，推斷活性化合物結構，篩選出活性成分。通過制備純化目標化合物或購買目標化合物標準品等方式，獲取活性成分，再采用活性評價方法驗證目標化合物的藥效活性。

本發明的另一個目的是提供所述方法在復雜天然產物中篩選活性成分中的應用。所述復雜天然產物包括天然產物提取物、中藥提取物或含多種化學成分的混合物。

本發明應用多通道高效液相色譜作為分離單元、質譜作為聯用的檢測分析單元、各型號孔板自動餾分收集儀作為收集單元與藥效活性評價單元，上述單元構成了一體化的天然產物分離分析與活性快速篩選系統。/可見光檢測器相連然后與電噴霧質譜儀相連，構成一體化的分離分析檢測系統；從高效液相泵分出來的另一路管線與多個進樣器相連后與多通道并行的色譜柱連接作為并行分離系統，然后通過毛細管與各型號孔板自動餾分收集儀連接作為自動收集系統，在本系統進行分離制備后可一次得到多塊孔板，可進一步進行基于細胞、酶或者化學反應的活性評價，活性篩選數據又可以與分析檢測數據進行比對分析得到活性化合物信息，實現了分離制備、分析檢測與活性篩選的連貫結合。[51]?

本發明提供了一種針對復雜樣品的并行分離制備、分析和自動收集方法，使之具有能與藥效活性篩選連貫結合的特點，具有快速分離、自動收集和活性快速篩選結合等顯著優點。該系統的優點在于采用5通道并行液相色譜進行天然產物的分離，并能夠將樣品直接制備到匹配的微孔板中，用于活性快速篩選。