[發(fā)明專利]檢測(cè)炭疽桿菌的引物、雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒及快速可視化檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210306985.1
• 申請(qǐng)日: 2012-08-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102816849A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張錦海;王長(zhǎng)軍;譚維國(guó);呂恒;曹勇平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 何朝旭

1.一種用于LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的引物，其特征是，包括lef引物序列集和gyrB引物序列集；其中，

lef引物序列集包括外引物對(duì)LF-F3和LF-B3，以及內(nèi)引物對(duì)LF-FIP和LF-BIP；LF-F3的序列如SEQ?ID?NO:1所示，LF-B3的序列如SEQ?ID?NO:2所示，LF-FIP的序列如SEQ?ID?NO:3所示，LF-BIP的序列如SEQ?ID?NO:4所示；

gyrB引物序列集包括外引物對(duì)gy-F3和gy-B3，內(nèi)引物對(duì)gy-FIP和gy-BIP，以及環(huán)引物對(duì)gy-LF和gy-LB；gy-F3的序列如SEQ?ID?NO:5所示，gy-B3的序列如SEQ?ID?NO:6所示，gy-FIP的序列如SEQ?ID?NO:7所示，gy-BIP的序列如SEQ?ID?NO:8所示，gy-LF的序列如SEQ?ID?NO:9所示，gy-LB的序列如SEQ?ID?NO:10所示。

2.一種雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，包括權(quán)利要求1所述用于LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，還包括2×反應(yīng)緩沖液，所述反應(yīng)緩沖液含有30-60mmol/L?pH8.8的Tris-HCl，16-30mmol/L的KCl，10-30mmol/L的(NH₄)₂SO₄，質(zhì)量濃度為0.1-0.3%的TritonX-100，由濃度均為2.0-3.6mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP組成的dNTPs，0.1-2.0mmol/L的甜菜堿C₅H₁₁NO₂，以及14-18mmol/L的MgCl₂。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，還包括濃度為6-12U/μl的BstDNA聚合酶，以及濃度為2-20mmol/L的金屬離子指示劑HNB儲(chǔ)存液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒，其特征是，還包括陽(yáng)性對(duì)照品：濃度為20-100mg/L的含有炭疽桿菌lef基因片段及gyrB基因片段的質(zhì)粒PGEM-lef-gyrb。

6.一種雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的快速可視化檢測(cè)方法，其特征是，采用權(quán)利要求5所述雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒，該方法包括以下步驟：

第一步、向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2×反應(yīng)緩沖液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B；其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入Ⅱ管的引物混合液；試劑盒2×反應(yīng)緩沖液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水的體積比為（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；

第二步、向反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的待測(cè)核酸樣品，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻；

第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60℃-64℃恒溫條件下放置45-80min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，再置于80℃-95℃5-10min滅活BstDNA聚合酶；

第四步、觀察反應(yīng)液A、B的顏色，若兩者顏色均為天藍(lán)色，則待測(cè)核酸樣品的來(lái)源含有炭疽桿菌強(qiáng)毒株或弱毒株；若兩者顏色均為紫羅蘭色，則待測(cè)核酸樣品的來(lái)源不含炭疽桿菌；若反應(yīng)液A顏色為紫羅蘭色，且反應(yīng)液B顏色為天藍(lán)色，則待測(cè)核酸樣品的來(lái)源含有炭疽桿菌弱毒株或無(wú)毒株；若反應(yīng)液A顏色為天藍(lán)色，且反應(yīng)液B顏色為紫羅蘭色，則待測(cè)核酸樣品的來(lái)源含有具有毒性質(zhì)粒pX01的蠟樣芽胞桿菌。

7.一種針對(duì)權(quán)利要求5所述雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒的檢驗(yàn)方法，其特征是，包括以下步驟：

第一步、制備兩套含反應(yīng)液A的反應(yīng)管A、含反應(yīng)液B的反應(yīng)管B：向透明反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的試劑盒2×反應(yīng)緩沖液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水，然后混合，得到體積相同的反應(yīng)液A、B；其中反應(yīng)管A中加入I管的引物混合液，反應(yīng)管B中加入Ⅱ管的引物混合液；試劑盒2×反應(yīng)緩沖液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、顯色液、超純水的體積比為（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；

第二步、向第一套反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的蒸餾水，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻，作為陰性對(duì)照；向第二套反應(yīng)管A、B中分別加入體積相同的陽(yáng)性對(duì)照品，蓋好反應(yīng)管A、B后混勻，作為陽(yáng)性對(duì)照；蒸餾水、陽(yáng)性對(duì)照品的加入體積相同；

第三步、將反應(yīng)管A、B先分別在60℃-64℃恒溫條件下放置45-80min進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，再置于80℃-95℃5-10min滅活BstDNA聚合酶；

第四步、觀察陰性對(duì)照反應(yīng)液A、B和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液A、B的顏色，若陰性對(duì)照反應(yīng)液A、B顏色均為紫羅蘭色，且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液A、B顏色均為天藍(lán)色，則第一步所用試劑盒是正常的；若各反應(yīng)液顏色與前述情況不完全相符或完全不相符，則第一步所用試劑盒不正常。