[發(fā)明專(zhuān)利]檢測(cè)炭疽桿菌的引物、雙重LAMP檢測(cè)炭疽桿菌的試劑盒及快速可視化檢測(cè)方法

無(wú)效

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• 申請(qǐng)日: 2012-08-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102816849A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張錦海;王長(zhǎng)軍;譚維國(guó);呂恒;曹勇平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇科專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 32102
• 代理人: 何朝旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于以L(fǎng)AMP法檢測(cè)炭疽桿菌的引物、含有該引物的試劑盒、采用該試劑盒的檢測(cè)方法、以及針對(duì)該試劑盒的檢驗(yàn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

炭疽桿菌是人畜共患致病菌，可通過(guò)皮膚接觸、呼吸道及消化道感染人和動(dòng)物，具有高度致病性，其中肺炭疽被列為中國(guó)國(guó)家法定甲類(lèi)傳染病（最高級(jí)別）。炭疽桿菌可通過(guò)空氣飛沫傳播，可形成氣溶膠，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件；而炭疽桿菌芽孢可存活十年以上，可構(gòu)成公共衛(wèi)生隱患。炭疽桿菌嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命安全，其檢測(cè)和預(yù)防一直倍受重視。?

然而，目前的檢測(cè)方法面臨兩個(gè)主要問(wèn)題：一是如何在條件較簡(jiǎn)陋的事發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速確定是否存在炭疽桿菌；二是如何快速診斷出炭疽強(qiáng)毒株，以挽救吸入性感染炭疽強(qiáng)毒株的病人生命，同時(shí)確定針對(duì)目標(biāo)人群的強(qiáng)制性隔離防疫措施等。?

傳統(tǒng)炭疽桿菌的檢測(cè)診斷都是基于形態(tài)學(xué)特征或表型特征，如革蘭氏陽(yáng)性染色試驗(yàn)、噬菌體試驗(yàn)、串珠和青霉素抑制試驗(yàn)、拉絲試驗(yàn)〈粘型菌落〉、溶血試驗(yàn)、芽孢形成試驗(yàn)等，這些方法在一定程度上都存在著費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)，均不適合早期快速偵檢。?

現(xiàn)有技術(shù)中，免疫膠體金技術(shù)、常規(guī)PCR及DNA探針雜交技術(shù)，均存在特異性和敏感性的問(wèn)題；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高，可靠性好，是全封閉反應(yīng)，但是該技術(shù)需要價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀，無(wú)法在很多中小醫(yī)院和基層防疫機(jī)構(gòu)普及，且為了保證高特異性往往需要熒光標(biāo)記探針，檢測(cè)成本較高。此外，精密貴重儀器對(duì)質(zhì)量控制、操作環(huán)境和人員的專(zhuān)業(yè)能力要求較高，難以在疫情現(xiàn)場(chǎng)使用。?

2000年，日本學(xué)者Notomi等開(kāi)發(fā)出一種新技術(shù)——LAMP法（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法），擴(kuò)增反應(yīng)全過(guò)程均在同一溫度下進(jìn)行，不須像PCR反應(yīng)那樣需要經(jīng)歷幾十個(gè)溫度變化的循環(huán)過(guò)程，因此對(duì)擴(kuò)增所需儀器的要求大大簡(jiǎn)化，僅需水浴鍋或其它小型恒溫加熱器即可，并且反應(yīng)時(shí)間縮短。?

LAMP法的基本原理是：針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4~6條引物（包括2條內(nèi)引物和2條外引物，可另加2條非必需的環(huán)引物），在具有鏈置換特性的Bst?DNA聚合酶作用下，外引物的延伸產(chǎn)物將內(nèi)引物的延伸產(chǎn)物置換出來(lái)，形成一個(gè)啞鈴狀的DNA，然后進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段，最終形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物。?

LAMP法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）較高特異性和抗干擾能力，只有當(dāng)2對(duì)引物與目的片段的6個(gè)區(qū)域都匹配上時(shí)才能進(jìn)行擴(kuò)增；（2）反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩(wěn)定，并且對(duì)于樣品中原有或污染的無(wú)關(guān)、干擾片段仍然不敏感，而其他類(lèi)似技術(shù)則無(wú)法做到這一點(diǎn)；（3）敏感性較高，擴(kuò)增快速、高效，1小時(shí)內(nèi)產(chǎn)物量可達(dá)約10¹⁰倍，約為普通PCR的1000倍。因此，LAMP法為病原微生物的核酸檢測(cè)提供了一個(gè)更簡(jiǎn)便、更快速、更有效的手段，尤其適用于疫情現(xiàn)場(chǎng)、野外工作、基層單位等條件相對(duì)簡(jiǎn)陋的環(huán)境。?

但是，目前應(yīng)用于病原體檢測(cè)的LAMP法，幾乎都存在一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)手段主要是擴(kuò)增結(jié)束后開(kāi)蓋加入熒光染料SYBR?Green?I等顯色液，但在此過(guò)程中，很難避免核酸氣溶膠污染所致的后續(xù)假陽(yáng)性結(jié)果。出現(xiàn)假陽(yáng)性的主要原因是：由于擴(kuò)增結(jié)束后核酸片段產(chǎn)物量過(guò)于巨大，往往又是同一片段的重復(fù)序列，加熱后會(huì)形成氣溶膠，開(kāi)蓋后即揮散在空氣、塵埃中以及器皿、衣物、工作臺(tái)和耗材試劑等表面，而LAMP方法又過(guò)于靈敏，氣溶膠污染后將造成后續(xù)檢測(cè)的高假陽(yáng)性率。日本榮研公司的LA-320實(shí)時(shí)濁度儀專(zhuān)用于LAMP法，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度變化，無(wú)需開(kāi)蓋，可避免前述假陽(yáng)性現(xiàn)象，但該儀器價(jià)格昂貴約60萬(wàn)元，限制了其推廣應(yīng)用。?

此外，值得注意的是，現(xiàn)有利用某單一基因鑒定炭疽桿菌的方法并不完?全可靠：炭疽桿菌與枯草芽孢桿菌等其它蠟樣菌群有很高的同源性，重要區(qū)別在于炭疽桿菌含有2個(gè)與毒力密切相關(guān)的特異性質(zhì)粒(pX01和pX02)；pX01質(zhì)粒上包含分別編碼致死因子、保護(hù)性抗原、水腫因子的lef、PA和cya基因，pX02質(zhì)粒上則包含與芽孢形成有關(guān)的基因如capA、capB、capC基因。目前已有的炭疽桿菌核酸檢測(cè)方法基本上都會(huì)檢測(cè)這些質(zhì)粒上的特異致病因子，但是炭疽桿菌的質(zhì)粒并不穩(wěn)定，容易缺失而使炭疽桿菌成為弱毒株或無(wú)毒株，而且自然環(huán)境下這些質(zhì)粒可被導(dǎo)入其它菌株，即在普通蠟狀芽胞桿菌群間水平轉(zhuǎn)移。相較之下，炭疽桿菌的染色體表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可在準(zhǔn)確鑒定中發(fā)揮重要作用。?