[發(fā)明專利]一種IPTG誘導豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白表達的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210302993.9
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102978232A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設計）人: 吳紅云;徐進;王衛(wèi)芳
• 申請（專利權）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/34;C07K14/01
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發(fā)明涉及一種IPTG誘導豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白表達的方法，屬于疾病免疫技術領域。

背景技術

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原。除引起PMWS外，PCV2還能引起母豬繁殖障礙，仔豬先天性震顫等,并可能與豬皮炎腎病綜合征（PDNS）呼吸道疾病復合征（PRDC）等病密切相關，還可造成一些傳染病的繼發(fā)感染。PCV2主要在宿主的淋巴系統(tǒng)增殖，可致使B淋巴細胞凋亡，影響肺泡巨噬細胞的正常功能，降低外周血中CD8+分子含量，造成免疫抑制，從而易發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，給豬場疫病防治帶來困難。目前國內外豬場普遍存在PCV2，現(xiàn)已對全球養(yǎng)豬業(yè)構成重大危害已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的又一種新的重要傳染病。

PCV2含有2個主要的開放式閱讀框（Open?reading?frames，ORFs），其中ORF2編碼核衣殼蛋白（Cap蛋白），是病毒的主要結構蛋白。Blanchard等用桿狀病毒表達的PCV2核衣殼蛋白和ORF2核酸疫苗分別免疫仔豬，均可使仔豬對PCV2產生攻毒保護，且PCV2亞單位疫苗比接種DNA疫苗能產生更好的保護作用（An?ORF2?protein-based?ELISA?for?porcine?circovirus?type?2?antibodies?in?post-weaning?multisystemic?wasting?syndrome；Veterinary?Microbiology?2003(94):183-194）。Kamstrup等分別用ORF2DNA疫苗免疫小鼠，三免后從小鼠血清中能檢測到高水平的抗體。以上研究表明Cap蛋白可以誘導機體產生一定水平的抗體，對機體產生免疫保護作用（Immunisation?against?PCV2?structural?protein?by?DNA?vaccination?of?mice.Vaccine?2004(22):1358-1361）。

由于目前尚無有效疫苗用于預防PMWS，因此能研究出一種能有效預防PCV2的疫苗對養(yǎng)豬業(yè)生產具有重要的意義。迄今，國外有4種商品化PCV2疫苗相繼問世，其中梅里亞動物保健公司研發(fā)的PCV2疫苗為全病毒滅活苗，富道動物保健公司研制的PCV2疫苗（PCV2）是嵌合病毒滅活苗。而國內由洛陽普萊克生物工程有限公司與南京農業(yè)大學聯(lián)合研制的“圓健”豬圓環(huán)病毒滅活疫苗以及由上海海利生物藥品有限公司和哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)合研制的“圓畢凈”豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，但由于滅活苗具有對機體刺激時間短，需要多次接種，費用高等缺點，限制了其廣泛應用。Mahe和Liu等分別在sf9真核細胞及大腸桿菌中進行了PCV2Cap蛋白的表達，但Cap蛋白的表達量較低，利用sf9真核細胞及大腸桿菌中進行了PCV2Cap蛋白的表達的方法無法大量的應用，限制了PCV2疫苗的發(fā)展（Differential?recognition?of?ORF2?protein?from?type?1?and?type2?porcine?circoviruses?and?identification?of?immunorelevant?epitopes.J.Gen.Virol?2000(81):1815–1824；Characterization?of?a?previously?unidentified?viral?protein?in?porcine?circovirus?type2-infected?cells?and?its?role?in?virus-induced?apoptosis.J.Virol?2005(79):8262–8274）。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種IPTG誘導豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白表達的方法，以提高豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白表達量。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是一種IPTG誘導豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白表達的方法，具體步驟如下：

1）將pET28a-PCV2-ORF2原核表達載體，轉化大腸桿菌DH5a，經(jīng)過選擇性培養(yǎng)、單克隆液體培養(yǎng)、PCR檢測，選擇帶有目的條帶的菌液提取質粒；

2）將提取的質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)過選擇性培養(yǎng)、單克隆液體培養(yǎng)、PCR檢測，選擇帶有目的條帶的菌液，轉接培養(yǎng)；

3）在轉接培養(yǎng)的菌液中加入IPTG，在IPTG終濃度0.1-1.0mmlo/L條件下，10-37℃誘導豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白表達1-8小時；

4）取步驟3）不同條件制得的菌液，離心，棄上清液；