[發(fā)明專利]熒光分子修飾的納米銀探針及其試劑盒與在檢測人IgE中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210302369.9
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102830103A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許丹科;李慧;魏霞;羌維兵;李鐘卉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C09K11/06
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光分子修飾的納米銀探針及其試劑盒與在檢測人IgE中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

人免疫球蛋白IgE是一種和人的過敏反應(yīng)密切相關(guān)的一種低豐度蛋白，監(jiān)測人體內(nèi)IgE的變化，對于疾病的預(yù)防和診斷具有重要的意義。常用的檢測人IgE的方法有放射免疫測定法和酶聯(lián)免疫法，放射免疫的缺點(diǎn)是費(fèi)用高、時(shí)間長、放射性同位素易過期而且污染環(huán)境，而酶聯(lián)免疫法的缺點(diǎn)是需要使用雙抗體，成本較高，雙抗不易得到。適配體是具有三維空間結(jié)構(gòu)能特異性識別目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA或RNA分子，合成容易，易于修飾且穩(wěn)定。我們利用適配體功能化的納米銀可以實(shí)現(xiàn)對人IgE的特異識別。

納米銀具有優(yōu)良的光學(xué)特性，當(dāng)熒光分子距離納米銀一定距離時(shí)（最佳距離為8nm），納米銀能夠使熒光分子的熒光信號增強(qiáng)，利用納米銀增強(qiáng)熒光的特性，我們合成了同時(shí)有適配體分子和熒光分子修飾的納米銀探針來實(shí)現(xiàn)對人IgE的識別與檢測。我們建立了一種基于納米銀探針和熒光增強(qiáng)液的信號放大方法用于人IgE的高靈敏，特異性分析檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，是提供一種靈敏的熒光增強(qiáng)技術(shù)并適用于人IgE檢測的熒光分子修飾的納米銀探針。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題，是提供提供包含上述納米銀材料的試劑盒，用于人IgE的檢測。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題，是提供上述試劑盒在檢測人IgE中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種熒光分子修飾的納米銀探針，它以直徑為10~30nm的納米銀球?yàn)閮?nèi)核，銀球外表面鍵合有熒光分子鏈和適配體鏈；

其中，所述的熒光分子鏈為5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy5；

其中，所述的適配體鏈為：5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA?GGGGC?ACGTT?TATCCGTCCC?TCCTA?GTGGC?GTGCCCC。

上述熒光分子修飾的納米銀探針的制備方法，它包括如下步驟：

(1)在冰浴條件下，將2-20mmol/L硝酸銀溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氫化鈉溶液中，硝酸銀與硼氫化鈉的反應(yīng)摩爾比為1：3，不斷攪拌至反應(yīng)完全，然后補(bǔ)加硼氫化鈉溶液，補(bǔ)加的硼氫化鈉的摩爾量為上述參與反應(yīng)的硼氫化鈉的摩爾量的7％，繼續(xù)攪拌至室溫，得到納米銀溶液；

(2)將熒光分子鏈和適配體鏈按摩爾比(1~99):(1~9)加入步驟(1)得到的納米銀溶液中，靜置10~24小時(shí)，熒光分子鏈和適配體鏈的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為(100-1000):1；

所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為：5’AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巰基修飾，3’端由Cy5修飾；

所述的適配體鏈，其核苷酸序列為：5’AAAAA?AAAAA?AAAAA?GGGGC?ACGTTTATCC?GTCCC?TCCTA?GTGGC?GTGCC?CC3’，其5’端由巰基修飾；

(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入1×PBS緩沖溶液，使得混合體系中的PBS緩沖溶液的濃度為0.1×PBS，靜置3~10小時(shí)；

(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入1~5mol/L氯化鈉溶液，靜置2~4小時(shí)，重復(fù)加入氯化鈉溶液與靜置的步驟1~4次，使得氯化鈉的終濃度為0.1~0.3mol/L；

(5)將步驟(4)得到的混合體系靜置24~72小時(shí)，取上清液；

(6)將步驟(5)得到的上清液經(jīng)離心去除上清，取沉淀加入1×PBS緩沖溶液重懸，重復(fù)離心與重懸的步驟2~4次，1×PBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0.1~5倍；最后離心得到的沉淀用1×PBSM緩沖溶液重懸即得備用探針。

步驟(2)中，熒光分子鏈和適配體鏈摩爾比優(yōu)選為(1~10):(1~1:10)，最優(yōu)選為3:1；靜置時(shí)間優(yōu)選為15~20h，最優(yōu)選為18h；熒光分子鏈和適配體鏈的總摩爾量與納米銀摩爾量之比優(yōu)選為（200~300）:1，最優(yōu)選為288:1。

步驟(3)中，PBS緩沖溶液優(yōu)選為1×PBS，即包含如下物質(zhì)的水溶液：137mM?NaCl，2.7mM?KCl，10mM?Na₂HPO₄.12H₂O，2mM?KH₂PO₄；靜置時(shí)間優(yōu)選為6h。