[發明專利]熒光分子修飾的納米銀探針及其試劑盒與在檢測人IgE中的應用

有效

• 申請號: 201210302369.9
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102830103A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 許丹科;李慧;魏霞;羌維兵;李鐘卉
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C09K11/06
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種熒光分子修飾的納米銀探針，其特征在于，它以直徑為10~30nm的納米銀球為內核，銀球外表面鍵合有熒光分子鏈和適配體鏈；

其中，所述的熒光分子鏈為5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy5；

其中，所述的適配體鏈為：5’-SH-AAAAAAAAAAAAAAA?GGGGC?ACGTT?TATCCGTCCC?TCCTA?GTGGC?GTGCC?CC。

2.權利要求1所述的熒光分子修飾的納米銀探針的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟：

(1)在冰浴條件下，將2-20mmol/L硝酸銀溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氫化鈉溶液中，硝酸銀與硼氫化鈉的反應摩爾比為1：3，不斷攪拌至反應完全，然后補加硼氫化鈉溶液，補加的硼氫化鈉的摩爾量為上述參與反應的硼氫化鈉的摩爾量的7％，繼續攪拌至室溫，得到納米銀溶液；

(2)將熒光分子鏈和適配體鏈按摩爾比(1~99):(1~9)加入步驟(1)得到的納米銀溶液中，靜置10~24小時，熒光分子鏈和適配體鏈的總摩爾量與納米銀摩爾量之比為(100-1000):1；

所述的熒光分子鏈，其核苷酸序列為：5’AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巰基修飾，3’端由Cy5修飾；

所述的適配體鏈，其核苷酸序列為：5’AAAAA?AAAAA?AAAAA?GGGGC?ACGTTTATCC?GTCCC?TCCTA?GTGGC?GTGCC?CC3’，其5’端由巰基修飾；

(3)向步驟(2)得到的混合體系中加入1×PBS緩沖溶液，使得混合體系中的PBS緩沖溶液的濃度為0.1×PBS，靜置3~10小時；

(4)向步驟(3)得到的混合體系中加入1~5mol/L氯化鈉溶液，靜置2~4小時，重復加入氯化鈉溶液與靜置的步驟1~4次，使得氯化鈉的終濃度為0.1~0.3mol/L；

(5)將步驟(4)得到的混合體系靜置24~72小時，取上清液；

(6)將步驟(5)得到的上清液經離心去除上清，取沉淀加入1×PBS緩沖溶液重懸，重復離心與重懸的步驟2~4次，1×PBS緩沖溶液每次的加入體積為待加入的混合體系體積的0.1~5倍；最后離心得到的沉淀用1×PBSM緩沖溶液重懸即得備用探針。

3.根據權利要求2所述的熒光分子修飾的納米銀探針的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述的離心條件為10000~20000rpm條件下離心10~30分鐘。

4.權利要求1所述的熒光分子修飾的納米銀探針在制備檢測人IgE的試劑中的應用。

5.一種用于檢測人IgE的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含如下試劑：熒光分子修飾的納米銀探針、磷酸鹽緩沖液、Tween-20、羊抗人IgE、人IgE、硝酸銀、氫醌、牛血清白蛋白、醛基片基。

6.權利要求5所述的用于檢測人IgE的試劑盒在檢測人IgE中的應用。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，利用檢測IgE的試劑盒檢測人IgE含量的具體方法，依次順序包括如下步驟：

(1)配制溶液：

稀釋液：將20×PBS用二次水稀釋20倍至1×PBS；

洗滌液：1×PBS溶液按0.05％的體積比加入吐溫-20溶液；

陰性對照：將0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中，得1mg/ml?BSA溶液；

封閉液：將1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中即得10mg/ml?BSA封閉液；

底物：用1mg/ml?BSA配制所需濃度的羊抗人IgE標準樣品溶液；

熒光增強液：18.2mmol/L硝酸銀和1.82mmol/L氫醌等體積混合；

探針：用1×PBSM溶液配制1.3nmol/L的熒光分子修飾的納米銀探針；

(2)將不同濃度的羊抗人IgE溶液、待測樣品和陰性對照在醛基片上點樣，分別為25μl，4℃條件下固定過夜；

(3)每孔加入10~200μL封閉液，在37℃條件下封閉1~3小時，用洗滌液蕩洗5~15min，洗滌3~4次，拍干；

(4)在不同的孔中加入不同濃度的人IgE標準樣品溶液30μL，在37℃條件下反應1小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3~4次，拍干；在其余的孔中加入30μL樣品溶液，在37℃條件下反應1小時，用洗滌液蕩洗5min，洗滌3~4次，拍干；

(5)每孔加入1.3nmol/L熒光分子修飾的納米銀探針30μL，在37℃條件下反應1~3小時，用洗滌液蕩洗5~15min，洗滌3~4次，拍干；

(6)每孔加入30μL熒光增強液，避光反應1~8min，去離子水沖洗3~4遍，拍干；

(7)用Luxscan-10K/A?Microarray?Scanner生物芯片掃描儀掃描，不同濃度的人IgE標準樣品溶液對應不同的熒光信號強度，得到IgE標準曲線，由標準曲線計算得到樣品中人IgE的濃度。