[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210301765.X
• 申請日: 2012-08-22
• 公開（公告）號: CN103627669A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王曉冰;周國民;張素春
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/44;A61P27/02;C12Q1/02
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞誘導(dǎo)方法，具體涉及誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的方法。尤其誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞包括神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和色素上皮前體細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

在各種臨床疾病中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本領(lǐng)域共識(shí)，胚胎干細(xì)胞的研究對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有極為重要的意義。視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)位于眼眶內(nèi)的一部分，鑒于其易于獲取，并且隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與功能的深入了解，人們在探討細(xì)胞療法治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的過程中，使得視網(wǎng)膜成為研究的首選。近年來，人們通常利用視網(wǎng)膜來研究神經(jīng)祖細(xì)胞的發(fā)育過程，因此對視網(wǎng)膜的研究成為了新的熱點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道，許多目前尚無治療方法的眼科患者，如：年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related?macular?degeneration,AMD）、色素性視網(wǎng)膜炎（retinitis?pigmentosa,RP）等，均可受益于基于胚胎干細(xì)胞的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植療法。據(jù)報(bào)道，AMD是發(fā)達(dá)國家的主要致盲因素，全世界大約有2500萬至3000萬人受到這種疾病的影響。在英國，大約有1%的人口受到這種疾病的困擾。（數(shù)據(jù)來自皇家盲人師范學(xué)院和黃斑疾病學(xué)會(huì)）。

研究顯示，AMD患者和RP患者的視力喪失是由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的不可逆性損傷所造成的。然而，在這種情況下，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞大多還可能保留下來，因此使得感光細(xì)胞和RPE細(xì)胞的移植替換療法成為恢復(fù)患者視覺功能的一種很好的選擇。

RPE細(xì)胞移植治療AMD的效果已經(jīng)在自體移植中得到了證實(shí)，這種自體移植是將RPE層或脈胳膜層從周邊移植到黃斑區(qū)。但是，由于視網(wǎng)膜患者的數(shù)量眾多、自體移植手術(shù)比較復(fù)雜以及自體來源細(xì)胞的數(shù)目有限，使得人胚胎干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜細(xì)胞在視網(wǎng)膜修復(fù)中發(fā)揮極其重要的作用。

越來越多的研究數(shù)據(jù)表明，人胚胎干細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下可以定向分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞。隨著人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)的快速發(fā)展，由人胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞的誘導(dǎo)分化已經(jīng)有了較為完善的技術(shù)，但仍存在分化率比較低等缺陷。國際上有報(bào)道稱，人胚胎干細(xì)胞經(jīng)過一系列誘導(dǎo)分化，可以得到20%左右的視網(wǎng)膜神經(jīng)球，其余大約80%為前腦神經(jīng)球，其誘導(dǎo)分化方案得到的視網(wǎng)膜神經(jīng)球的總體效率偏低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的方法，尤其涉及誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞包括神經(jīng)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和色素上皮前體細(xì)胞的方法，更具體的涉及一種用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Neurobasal）、敲除的血清替代物（Knockout-Serum?replacement，KOSR）和煙酰胺（Nicotinamide，NIC)將人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的方法。該方法能有效解決視網(wǎng)膜細(xì)胞移植治療中因細(xì)胞分化效率低、細(xì)胞分化周期長等缺陷造成的難題。

本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述方法制得的細(xì)胞在用于治療視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞退行性變等疾病中的用途。

本發(fā)明方法，將人多能干細(xì)胞經(jīng)過懸浮、貼壁、再懸浮、消化等一系列誘導(dǎo)分化過程獲得陽性率比較高的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，具體是將人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞在含有N2的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)入含有神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Neurobasal）、敲除的血清替代物（Knockout?serum?replacement，KOSR）和煙酰胺（Nicotinamide，NIC）的視網(wǎng)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基，獲得所需的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞。

所述的人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞由美國威斯康辛大學(xué)張素春教授實(shí)驗(yàn)室提供，也可通過市購的渠道獲得（如：購自上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院華東干細(xì)胞庫和中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所的人類胚胎干細(xì)胞庫）。

本發(fā)明方法中，首先將人多能干細(xì)胞在神經(jīng)誘導(dǎo)培液中進(jìn)行分化，當(dāng)其開始出現(xiàn)類神經(jīng)管的結(jié)構(gòu)時(shí)，更換為視網(wǎng)膜細(xì)胞誘導(dǎo)分化培液。該方法中利用Neurobasal培養(yǎng)基、Knockout血清和NIC誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，能有效解決視網(wǎng)膜細(xì)胞移植治療中因細(xì)胞分化效率低、細(xì)胞分化周期長等缺陷造成的難題。

具體而言，本發(fā)明的誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括步驟：

（1）將人多能干細(xì)胞消化后，制成細(xì)胞球，第3天更換培養(yǎng)基為神經(jīng)誘導(dǎo)分化培液；

（2）第7天進(jìn)行貼壁，第14天更換培養(yǎng)基為視網(wǎng)膜細(xì)胞誘導(dǎo)分化培液；