[發明專利]一種檢測火鶴的SERK基因表達狀況的試劑盒及其方法

無效

• 申請號: 201210301235.5
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102925550A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: 張克中;崔金騰;王愛香;張睿鸝
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及一種基因檢測的方法，尤其是檢測火鶴的SERK基因表達狀況的方法。

背景技術

火鶴(Anthurium?andraeanum)又名紅掌、安祖花，為天南星科(Araceae)花燭屬(Anthurium)植物，原產南美洲熱帶雨林中。其花型獨特，佛焰苞明艷華麗，色彩豐富，花期長，葉形別致，觀葉觀花俱佳，是現在居室不可多得的裝飾珍品，世界花卉貿易中，紅掌是僅次于熱帶蘭的第二大熱帶花卉。我國在20世紀70年代引入栽培，目前已成為名貴的切花品種。

火鶴一般常用分株繁殖，速度很慢，偶爾也用扦插等方法進行繁殖，但成活率很低，而用播種繁殖必須經過人工授粉才能獲得種子，耗費人力，而且種子繁殖有較大變異，所以用常規方法難以擴大生產。目前，花燭組培快繁主要是通過器官發生途徑由不同外植體誘導形成愈傷組織，然后由愈傷組織誘導不定芽再生，進行繼代增殖。

通過器官發生途徑獲得再生植株并進行快速繁殖已成為一種較有效的繁殖方式，但仍存在外植體誘導愈傷組織周期較長，獲得無菌苗速度較慢，且無菌苗長期連續增殖極易發生退化和變異等缺點。而通過體細胞胚胎發生途徑再生植株在繁殖率、遺傳穩定性等方面均具有許多優勢，如一次性產生的體胚數量多，繁殖速度明顯比器官發生途徑快，遺傳性穩定、不易發生體細胞變異，還可以用于遺傳改良等。

目前我國研究大多停留在器官發生途徑的水平上，少有體細胞胚胎發生途徑的報道，且主要停留在形態細胞學的水平上。

發明內容

本發明的目的之一是通過以下技術方案來實現的：

以火鶴品種‘阿拉巴瑪’成熟植株新生幼嫩葉片為外植體，進行胚性愈傷組織發生的誘導，結果表明：在Al(1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.4mg/L?2，4-D)、A2(1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.6mg/L?2，4-D)、A3(1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L?2，4-D)、A4(1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.6mg/L2，4-D)3種培養基中獲得較高的愈傷誘導率，愈傷誘導率達到了85％以上。將啟動培養階段獲得的愈傷組織切割置于1/2MS+1.0mg/L?6-BA+0.1mg/L?KT+0.5mg/L?NAA上繼代培養，發現生成一種表面不光滑、質地疏松的新愈傷組織，后經細胞學觀察鑒定為胚性愈傷組織。將繼代培養獲得的新愈傷組織切割置于1/2MS+0.5mg/L6-BA培養基上進行發育培養，胚性愈傷組織繼續膨大，最后分散為單個的瘤狀物，直至長成為小植株。以火鶴胚性愈傷組織為材料，進行總RNA的提取。應用擴增得到的火鶴SERK基因的全長cDNA序列，設計特異性較強的引物CAGACGGTTCACTTGTGGCAG和ATCCACGAAGGCGAAGGAGGTT，以18S?rRNA作為內參基因，采用實時熒光定量PCR技術，分析了火鶴體胚誘導與發育階段SERK基因轉錄水平的表達變化情況，由圖3可知：18S?rRNA基因擴增得到的Ct值和起始模板稀釋數的相關性良好，顯示了很好的線性關系；標準曲線的斜率相差0.1左右，引物對兩個基因的擴增效率相近，可以采用2^-ΔΔCT方法分析后續數據；由圖4和圖5SERK基因擴增得到的S型熒光定量動力學曲線和融合曲線可知：SERK在實時熒光定量PCR過程中，熒光強度均有不同程度的增加，說明模板有擴增；在擴增過程中只存在單一峰，表明SERK基因的引物的特異性很好，沒有產生非特異性擴增和二聚體；根據熒光定量PCR內參基因18SrRNA和SERK基因的Ct值，見圖6，應用2^-ΔΔCT方法進行火鶴體細胞胚發生過程中不同發生發育階段培養物SERK基因的相對定量計算。以零處理的葉片作為對照，對其它11個不同時期培養物進行定量分析，結果如圖7，其中熒光定量表達分析標準曲線、溶解曲線、擴增曲線均符合擴增要求，可知：火鶴體細胞胚發生發育過程中三個不同培養時期SERK基因的表達呈現出3個階梯狀下降趨勢，其中誘導培養階段中誘導處理10d的葉片中含有的SERK基因的表達量是誘導處理30d的2倍，其后的培養中SERK基因的表達量顯著下降。將誘導培養階段獲得的愈傷組織接種到繼代培養基上，繼代培養10d后，檢測到SERK基因大量表達，其相對表達量達到17.92，可能是在這個時期SERK基因的大量表達促使了胚性愈傷組織的發生，到繼代培養一個月后SERK基因的表達接近于無。將繼代培養獲得的胚性愈傷組織接種到胚發育培養基上后，SERK基因的表達又略有增加，但是僅僅是胚性愈傷組織發生階段的1/3，其后隨著胚的發育，SERK基因的表達又逐漸減少。