[發(fā)明專利]一種檢測火鶴的SERK基因表達(dá)狀況的試劑盒及其方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210301235.5
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102925550A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張克中;崔金騰;王愛香;張睿鸝
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種檢測火鶴的SERK基因表達(dá)狀況的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

(1)愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)、發(fā)育培養(yǎng)：取剛展開的幼嫩葉片為外植體材料，經(jīng)過0.1％升汞3min表面滅菌后，用無菌水沖洗4-5遍，將葉片沿中脈切成1×1cm葉片切塊平鋪接種于1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/L2，4-D培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基Ph值為5.8，于25±2℃黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到了85％以上，兩個月后待粒狀愈傷組織連成片后，將愈傷組織切割置于1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L?KT+0.5mg/L?NAA上繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)獲得的新愈傷組織切割置于1/2MS+0.5mg/L6-BA培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)，將啟動培養(yǎng)獲得的愈傷組織切成小塊，轉(zhuǎn)入不加2，4-D的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)20～30d；

(2)以火鶴胚性愈傷組織為材料，用改良的CTAB法提取總RNA；

(3)設(shè)計一對引物進(jìn)行火鶴體胚發(fā)生過中SERK基因表達(dá)實(shí)時熒光定量試驗(yàn)，長度為129bp；

YGPCR?forward1：CAGACGGTTC?ACTTGTGGCAG

YGPCR?reverse1：ATCCACGAAG?GCGAAGGAGG?TT

以18S?rRNA基因作為內(nèi)參，采用實(shí)時熒光定量PCR分析火鶴體胚發(fā)生發(fā)育過程中SERK基因表達(dá)的變化規(guī)律，18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，片段長度171bp，

18S?rRNA?F：CCTGAGAAACGGCTACCACAT

18S?rRNA?R：CACCAGACTTGCCCTCCA。

2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測火鶴的SERK基因表達(dá)狀況的方法，其特征在于：改良CTAB提取法為：

(1)取2mL離心管，加CTAB裂解液900μL，β-巰基乙醇30μL，65℃水浴10min；

(2)稱取100mg胚性愈傷組織于液氮中研磨。將預(yù)熱的CTAB裂解液加入到研缽中裂解，融化后迅速轉(zhuǎn)入2mL離心管，渦旋混勻30s，65℃水浴5min；

(3)加入1mL氯仿/異戊醇，渦旋混勻，4℃，10000rpm，離心15min；；

(4)取上清至新的2mL離心管，加入2μL的DNase?I和5μLBuffer，37℃反應(yīng)20min，4℃，10000rpm，離心15min；

(5)取上清至新的2mL離心管，加入1mL氯仿/異戊醇，渦旋混勻，4℃，10000rpm，離心15min；

(6)取上清至1.5mL離心管，加入1/3體積的8mol/L?LiCl，4℃沉淀不超過16h；

(7)4℃，12000rpm離心20min，棄上清，加入500μL70％乙醇懸浮沉淀；

(8)4℃，12000rpm離心5min，加入500μL100％乙醇，棄上清，室溫倒置1min；

(9)加入30μL?RNAse-free水溶解RNA，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3.一種檢測火鶴的SERK基因表達(dá)狀況的試劑盒，其特征在于：該試劑盒中實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系(25μL)為：

PCR反應(yīng)程序：

18S?rRNA基因擴(kuò)增：預(yù)變性95℃30sec；95℃變性10sec；62℃退火30sec；循環(huán)數(shù)50；

火鶴SERK基因擴(kuò)增：預(yù)變性95℃30sec；95℃變性10sec；62℃退火30sec；循環(huán)數(shù)50。