[發明專利]單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201210300572.2
• 申請日: 2012-08-22
• 公開（公告）號: CN102816793A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 夏海濱;陳皓
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術領域

本發明涉及生命科學領域，具體涉及到單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統及其構建方法和應用。?

背景技術

基因治療是目前腫瘤治療領域很有希望的治療方法之一，而基因治療中對所用治療基因的準確快速的調控對提高療效，減少治療基因帶來的負作用至關重要。Tet-on誘導表達系統，是四環素誘導系統的一種，特點是加入四環素或者其衍生物如強力霉素（Doxycycline，Dox）等誘導藥物后，受控基因表達開啟。Tet-on誘導表達系統是廣泛應用的誘導表達系統，具有本底低，高誘導倍數，高特異性，誘導劑無明顯毒性等優點，非常適合對治療基因的調控。現階段，該系統已被應用于諸多疾病的研究和治療中。但現有的Tet-on誘導表達系統依然存在較明顯的本底滲漏和調控蛋白過量表達對細胞的干擾作用，同時以往Tet-o誘導表達系統的建立需要調控載體和反應載體兩個質粒，如此降低了系統建立的效率。單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統可以克服兩質粒系統的缺點，同時具有低本底滲漏，并易于用于如腺病毒等載體，因此對于腫瘤治療至關重要。?

通過建立一種全部調控系統和目的基因都位于一個載體上，并具有低本底滲漏和高效誘導倍數的Tet-on誘導表達系統，實現對各種基因，如報告基因或者抗腫瘤基因TRAIL的有效調控表達；并能應用到如腺病毒載體等病毒載體上，使其獲得的具有更好的活力，為腫瘤基因治療提供有力的工具。?

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題在于提供一種單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統。?

本發明所要解決的另一個技術問題在于提供一種單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統的構建方法。?

本發明所要解決的還有一個技術問題在于為單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統提供一種新用途。

解決上述技術問題采用的技術方案是：單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統元件的連接順序為5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-?Tight-PminCMV-EcoR?Ⅰ-Spe?Ⅰ-SV40polyA-3’，Tight-PminCMV左側的復合元件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE的連接方式為3’-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’-5’-Tight-PminCMV-3’，其余元件均按與該系統相同方向5’-3’順序連接；兩個酶切位點EcoR?Ⅰ和Spe?Ⅰ位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之間，該系統序列如核苷酸序列表中No.11。?

本發明的TRE元件左側的PminCMV元件的方向與右側的Tight-PminCMV啟動方向相反，均與TRE元件相鄰。?

在本發明單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統的EcoR?Ⅰ與Spe?Ⅰ位點間連入的目的基因是報告基因或腫瘤治療基因。?

單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統的構建方法包括下述步驟：?

1、構建含有KpnⅠ-Cla?Ⅰ-Not?Ⅰ-Xho?Ⅰ-EcoR?Ⅰ-Spe?Ⅰ限制性內切酶位點的腺病毒E1區穿梭載體?

使用酶切連接法將DNA?linker（KpnⅠ-Cla?Ⅰ-Not?Ⅰ-Xho?Ⅰ-EcoR?Ⅰ-Spe?Ⅰ-Spe?Ⅰ）連接入腺病毒E1區穿梭載體，獲得所需要的載體；?

2、擴增構建單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統所需的元件?

通過聚合酶鏈式反應擴增構建單載體雙向啟動的Tet-on誘導表達系統所需的元件，元件包括CMV、TetR-KRAB、SV40polyA、Tight-PminCMV、rtTA2S-M2。?

3、構建帶有復合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體?

通過酶切連接，將TRE-PminCMV連接至pShuttle-KSL-SV40polyA-KB，并使用KpnⅠ酶切后，T4?DNA聚合酶補平末端，再用T4?DNA連接酶進行平末端連接，使TRE-PminCMV序列中304位的KpnⅠ位點消失，獲得TRE-KB-PminCMV元件；再將rtTA2S-M2連接到TRE-KB-PminCMV的3’端，同樣方法使TRE-KB-PminCMV與rtTA2S-M2間的EcoR?Ⅰ位點消失，得到帶有復合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體pShuttle-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA。?