[發明專利]分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法

有效

• 申請號: 201210299399.9
• 申請日: 2012-08-21
• 公開（公告）號: CN102809596A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 談學海;林佩元;陳景才;范柳
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物技術，特別涉及一種分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法。

背景技術

T型鈣離子通道主要存在于心臟、神經組織、腎臟、平滑肌、精子以及多種內分泌器官。T型鈣流存在于心臟浦肯野纖維細胞、竇房結、潛在起搏細胞上，有助于起搏細胞的復極，動作電位的始動，竇房結自律性，在起搏細胞動作電位平臺期上發揮著重要的作用。同時，T型鈣通道也參與了肌肉興奮-收縮偶聯，內分泌腺的興奮-分泌偶聯及細胞的調控過程。

研究證明，T型鈣通道不僅是治療腎性高血壓和心律失常，也是治療意識喪失型癲癇及神經性疼痛的重要藥物靶點。此外，細胞內鈣超載與房顫、心衰、偏頭痛、阿爾茨海默病、睡眠障礙等發病有關。因此，觀察藥物對T型鈣通道的作用已成為協助評價治療心血管及神經系統疾病藥物藥效的重要手段。膜片鉗技術被稱為研究離子通道的“金標準”，是研究離子通道的最重要的技術。

傳統的胰蛋白酶化學消化法分離細胞及含血清培養基維持細胞生長雖簡便易行，但存在接種的細胞貼壁不良，生長時間較短及神經元純度欠佳等問題。細胞外灌流液中直接去除了鈉離子，造成實驗過程中細胞存活時間明顯縮短等缺陷，需要進行改良劑提高，從而確保實驗的成功率，穩定性和重復性。

發明內容

本發明的目的，在于克服上述現有技術存在的缺陷，提供一種易操作、能提高神經細胞收獲率和純度的分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法。

本發明的目的是這樣實現的：一種分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法，包括以下步驟：

A、選取新生24h的SD大鼠，處死并在無菌條件下取出全腦后，用解剖液清洗數次；

B、置于冰浴中解剖，小心分離得到皮層，仔細剔除皮層上的微細血管后，充分剪碎皮層組織；

C、將剪碎的皮層組織置于廣口瓶內，加入同體積的0.25％的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，置于5％二氧化碳、37℃培養箱內消化18-25分鐘；

D、充分消化后，加入數滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕吹打數分鐘至液體成迷糊狀即停止吹打，用70微米網篩過濾，收集細胞懸液；

E、將細胞懸液以1000rpm離心5分鐘，棄上清，根據計數結果，調整細胞密度，接種于放置了多聚賴氨酸包被處理的蓋玻片培養皿，用添加了B27的Neurobasal培養液，置于37℃、5％二氧化碳培養箱中培養7-21天，得到生長有皮層神經細胞的蓋玻片；

F、將生長有皮層神經細胞的蓋玻片加入灌流槽中，置于倒置顯微鏡載物臺上，用細胞外灌流液灌流清洗細胞，流速保持1-1.5毫升/分鐘；選擇生長飽滿的細胞進行膜片鉗實驗，采用標準的全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄T型鈣通道電流；實驗在22-25℃下進行，使用的玻璃電極充滿細胞內灌流液，電阻為3-5兆歐。

上述分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟A中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素及鏈霉素、5毫升濃度為1摩爾的氯化鎂、3.5毫升濃度為1摩爾的HEPES和5毫升濃度為200毫摩爾的L-glutamine配制而成，經過濾且高壓滅菌后4℃冷藏備用。

上述分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟F中所述的細胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl₂、CaCl₂、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH調節pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，CsCl的濃度為5.4mM，MgCl₂的濃度為1mM，CaCl₂的濃度為1.8mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM，溶液的滲透壓為290mOsm；

上述分離培養新生鼠皮層神經細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟F中所述的細胞內灌流液由CsCl、四乙基氯化銨、CaCl₂、鎂-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH調節pH至7.2，配制成的溶液中，CsCl的濃度為120mM，四乙基氯化銨的濃度為20mM，CaCl₂的濃度為1mM，鎂-三磷酸腺苷的濃度為5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的濃度為11mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為10mM；溶液的滲透壓為310mOSm。