[發(fā)明專利]分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201210299399.9 | 申請(qǐng)日： | 2012-08-21 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN102809596A | 公開（公告）日： | 2012-12-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 談學(xué)海;林佩元;陳景才;范柳 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 輝源生物科技（上海）有限公司 |
| 主分類號(hào)： | G01N27/26 | 分類號(hào)： | G01N27/26 |
| 代理公司： | 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225 | 代理人： | 楊元焱 |
| 地址： | 201203 上海市浦*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 分離 培養(yǎng) 新生 皮層 神經(jīng)細(xì)胞 記錄 通道 電流 方法 | ||
1.一種分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于，包括以下步驟：
A、選取新生24h的SD大鼠，處死并在無菌條件下取出全腦后，用解剖液清洗數(shù)次；
B、置于冰浴中解剖，小心分離得到皮層，仔細(xì)剔除皮層上的微細(xì)血管后，充分剪碎皮層組織；
C、將剪碎的皮層組織置于廣口瓶內(nèi)，加入同體積的0.25％的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，置于5％二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化18-25分鐘；
D、充分消化后，加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕吹打數(shù)分鐘至液體成迷糊狀即停止吹打，用70微米網(wǎng)篩過濾，收集細(xì)胞懸液；
E、將細(xì)胞懸液以1000rpm離心5分鐘，棄上清，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于放置了多聚賴氨酸包被處理的蓋玻片培養(yǎng)皿，用添加了B27的Neurobasal培養(yǎng)液，置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-21天，得到生長有皮層神經(jīng)細(xì)胞的蓋玻片；
F、將生長有皮層神經(jīng)細(xì)胞的蓋玻片加入灌流槽中，置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，用細(xì)胞外灌流液灌流清洗細(xì)胞，流速保持1-1.5毫升/分鐘；選擇生長飽滿的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄T型鈣通道電流；實(shí)驗(yàn)在22-25℃下進(jìn)行，使用的玻璃電極充滿細(xì)胞內(nèi)灌流液，電阻為3-5兆歐。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于：步驟A中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素及鏈霉素、5毫升濃度為1摩爾的氯化鎂、3.5毫升濃度為1摩爾的HEPES和5毫升濃度為200毫摩爾的L-glutamine配制而成，經(jīng)過濾且高壓滅菌后4℃冷藏備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于：步驟F中所述的細(xì)胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2、CaCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，CsCl的濃度為5.4mM，MgCl2的濃度為1mM，?CaCl2的濃度為1.8mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM，溶液的滲透壓為290mOsm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于；步驟F中所述的細(xì)胞內(nèi)灌流液由CsCl、四乙基氯化銨、CaCl2、鎂-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2，配制成的溶液中，CsCl的濃度為120mM，四乙基氯化銨的濃度為20mM，CaCl2的濃度為1mM，鎂-三磷酸腺苷的濃度為5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的濃度為11mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為10mM；溶液的滲透壓為310mOSm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于：步驟E中所述的置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-21天的具體做法是，每六天換培養(yǎng)液一次，每次換半量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于：步驟F中所述的電壓鉗模式為，鉗制電壓-90毫伏，施予100毫秒的-30毫伏去極化脈沖。?
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