[發明專利]超高處理量光學-納米孔DNA讀出平臺

無效

• 申請號: 201210298157.8
• 申請日: 2005-08-12
• 公開（公告）號: CN102925549A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發明（設計）人: A·梅勒;J·麥瑟;J·S·埃德
• 申請（專利權）人: 哈佛學院院長等
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 袁泉

本申請是申請日為2005年8月12日、申請號為200580032954.X、發明名稱為“超高處理量光學-納米孔DNA讀出平臺”的發明專利申請的分案申請。

發明領域

本發明提供了分析聚合物分子的系統。更具體地，本發明涉及單鏈多核苷酸分子測序。

背景

自從Watson和Crick于1953年闡明DNA分子的結構以來，遺傳研究人員已經試圖發現快速且有效的對單個DNA分子測序的方法。在1975至1977年間，Sanger/Barrell和Maxam/Gilbert開發了2種進行DNA測序的新方法，它們代表著測序技術的重大突破。今天廣泛使用的所有方法都是基于Sanger/Barrell方法，近23年來DNA測序的發展是對該方法的或多或少的改進。

多核苷酸是包含以線性方式結合到一起的核苷酸的重復單元的聚合分子。多核苷酸的實例是脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA聚合物由4種稱作腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的不同核苷酸堿基串組成。這些堿基在特定基因中的特定順序或“序列”，決定著基因編碼的蛋白的結構。而且，基因周圍的堿基序列典型地含有關于在何種細胞類型中以何種頻率產生特定蛋白等的信息。了解基因中和周圍的DNA序列，會提供關于基因的結構和功能、它編碼的蛋白、它與其它基因和蛋白的關系的有價值的信息。RNA在結構上和化學上與DNA有關，但是，RNA的糖組分是核糖(與DNA不同，后者是脫氧核糖)，且堿基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。

本領域的技術人員會認識到，特定的DNA序列和某些疾病狀態之間存在直接的關系。該事實已經促使許多制藥公司大量地投入到基因組研究領域，希望發現這些疾病潛在的遺傳性質。

序列信息重要的另一個原因是，期望的基于他或她的遺傳學序列確定個體對特定疾病的易感性的能力。遺傳診斷學領域致力于鑒別其在基因組中的存在與特定障礙或特征的發生有關的核苷酸序列元件。可得到的關于在人群中觀察到的基因組序列元件的信息越多，該領域變得越有力。而且，越迅速地測試關于序列元件在總體人群中的流行率和外顯率的信息，以及這樣的元件在特定個體的基因組中的存在，分析變得越有效。

序列信息有價值的另一個原因是，許多制藥公司試圖開發針對個體的遺傳學特征定制的藥物。目的是提供靶向的有效藥物，可能使用與施用該藥物的特定個體的遺傳特性相適應的降低的劑量水平。

大多數目前可得到的核苷酸測序技術如下確定給定多核苷酸鏈的核苷酸序列：建立不同長度的互補鏈的集合，使得該集合包括在目標序列的每個堿基處終止、且大小范圍從僅幾個核苷酸至目標分子全長的分子。然后，通過分析截短的互補鏈，并確定4種DNA核苷酸中的每一種終止了哪些鏈，確定目標分子的序列。通過按長度順序排列截短的分子，構建″梯子″，并讀出每個梯級的末端殘基，以提供目標多核苷酸序列的互補物。

目前可得到的DNA測序系統非常有力。但是，它們受到它們的速度、它們的復雜性和它們的成本的限制。目前可得到的自動測序儀的速度受到機器不能一次分析序列中超過數百(典型地，約600)核苷酸的限制。考慮到將小于1000堿基長度的鏈正確地拼接到一起所需的重疊，標準的測序過程必須進行多達7000萬次，以便確定人基因組序列(Technology?Review?102(2)：64-68?1999?Mar/Apr；在本文中引作參考)。甚至以每天1億堿基的理論速度，將人基因組測序一次也需要至少一年。利用這些技術，大規模測序不會變成臨床工具。為了使遺傳診斷學可在臨床環境中實踐，測序速度必須提高至少3至5個數量級。

現有的測序技術的復雜性源自擴增和修飾待測序的遺傳分子的需要。化學地或酶促地進行該修飾，通過許多加熱和冷卻的循環實現擴增。擴增和修飾待測序的DNA的更為流行的方式之一是，使用聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR包含變性、退火和使用DNA聚合酶延伸的連續循環，并導致DNA的起始鏈的指數擴增。與循環的每個部分有關的時間長度，取決于液體體積和待擴增的DNA的長度。典型的時間是下述量級：變性步驟10-30秒，退火步驟5-30秒，和延伸步驟1-4分鐘。該循環通常進行15至30次。因此，根據待擴增的DNA的長度，常見的PCR時間是1至3小時。限制變性、退火和標記的根本物理過程是：需要的可檢測鏈的數目，進行該過程所需的時間，和酶的持續合成能力。這整個過程耗時，且需要遵循有關操作。

目前，需要更有效的對多核苷酸測序的方法。本發明提供了這樣的方法。

簡述