[發(fā)明專利]一種對(duì)丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210295351.0
• 申請(qǐng)日: 2012-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN102807615A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李相前;任世英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮陰工學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K14/765
• 分類號(hào): C07K14/765;C07K1/113;C07C255/39;C07C253/30
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1.一種對(duì)丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，該合成方法包括：

以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應(yīng)合成溴氰菊酯化合物；

通過重氮化反應(yīng)，合成半抗原Hp-1；

利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1與載體蛋白BSA相偶聯(lián)，制備溴氰菊酯人工免疫抗原。

2.如權(quán)利要求1所述的對(duì)丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應(yīng)合成溴氰菊酯化合物，合成步驟如下：

向150mL的三口燒瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿攪拌溶解，溶液呈透明黃色，取發(fā)煙硝酸10.21mL與16mL乙酸置于恒壓滴液漏斗中充分混勻，緩慢向反應(yīng)瓶中滴加，1.5h滴加完畢，反應(yīng)液控制在25℃-30℃范圍內(nèi)，待滴加完畢，保持該條件繼續(xù)攪拌反應(yīng)3.5h；將反應(yīng)液倒入200mL的冰水中，攪拌，出現(xiàn)大量淡黃色粘稠物質(zhì)；用乙酸乙酯對(duì)水液進(jìn)行萃取，然后再用蒸餾水反復(fù)洗滌多次，收集有機(jī)相，無水Na₂SO₄干燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘稠液體。粗產(chǎn)物未經(jīng)純化，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)；

稱取上一步得到的產(chǎn)物5g，溶于裝有50mL乙醇的燒瓶中，加入9.8gSnCl₂·2H₂O，攪拌得白色的濁液，反應(yīng)體系用N₂保護(hù)，70℃-75℃下反應(yīng)35min。反應(yīng)液冷卻后，倒入150mL?H₂O中，攪拌，乳白色漿狀，加入200mL乙酸乙酯，并用10％的NaHCO₃溶液調(diào)節(jié)pH＝7，過程中溶液產(chǎn)生大量的氣泡，隨后加入適量的硅藻土，抽濾，再用蒸餾水和乙酸乙酯洗滌濾餅，收集濾液中的有機(jī)相，無水Na₂SO₄干燥，溶液逐漸由黃色變?yōu)榧t棕色溶液，抽濾，減壓蒸餾除去溶劑得紅褐色的油狀物。粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析，乙酸乙酯/石油醚＝1∶2，脫色純化得?淡黃色粘稠物，下一步進(jìn)行重氮化反應(yīng)。

3.如權(quán)利要求1所述的對(duì)丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，通過重氮化反應(yīng)，合成半抗原Hp-1，合成步驟如下：

在半抗原Hp-1的基礎(chǔ)上引入羧基活性基團(tuán)，并加入連接臂；

取上步反應(yīng)產(chǎn)物溶于鹽酸中，在冰冷卻下保持溫度在0-5℃之間，然后在攪拌情況下逐漸加入亞硝酸那溶液；反應(yīng)時(shí)，酸的用量為產(chǎn)物量的3倍，反應(yīng)式為：

Ar-NH₂+2HCL+NaNO₂＝ArN₂CL+NaCL+2H₂O

重氮化反應(yīng)后，取上步產(chǎn)物0.4g，加4mol/L的HCL溶液0.1925mL，15min后加入0.5mol/L的NaNO₂溶液1.54mL，反應(yīng)45min，得淡黃色液體。后加入丁二酸酐1.155g，反應(yīng)2h以上，反應(yīng)處于室溫中磁力攪拌下進(jìn)行，過夜后結(jié)束反應(yīng)；反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑，殘留固體用四氫呋喃處理，硅膠柱分離純化，薄層硅膠板上表現(xiàn)為一個(gè)斑點(diǎn)乙酸乙酯∶石油醚＝4∶1，Rf＝0.65。

4.如權(quán)利要求1所述的對(duì)丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1與載體蛋白BSA相偶聯(lián)，制備溴氰菊酯人工免疫抗原，具體步驟如下：

稱取0.31g半抗原Hp-1，再稱取0.131g?NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解于反應(yīng)裝置中，反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行10h；反應(yīng)終液置4℃冰箱冷卻2h以上，經(jīng)1.2萬rpm離心5分鐘，取上清，即活潑酯液，并緩慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反應(yīng)；反應(yīng)緩沖液為0.2mol/L?pH7.4的磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)在磁力攪拌下室內(nèi)溫度進(jìn)行4小時(shí)；將反應(yīng)終液置透析袋內(nèi)，于0.01mol/L?pH7.4的PBS溶液中4℃攪拌透析，每4-8小時(shí)換一次透析液，共透析3天，透析結(jié)束后將透析袋中的蛋白溶液，即為溴氰菊酯人工抗原Hp-1-BSA，分成若干等份分裝于1ml離心管中，于-20℃冰箱中存放備用。?