[發明專利]一種對丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法

無效

• 申請號: 201210295351.0
• 申請日: 2012-08-20
• 公開（公告）號: CN102807615A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 李相前;任世英
• 申請（專利權）人: 淮陰工學院
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/113;C07C255/39;C07C253/30
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技術領域

本發明屬于對丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原技術領域，尤其涉及一種對丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法。

背景技術

免疫分析是基于抗原、抗體的特異性反應的一種分析方法，在醫學上已廣泛應用于微量物質的檢測。免疫分析具有特異性強、靈敏度高，甚至更低、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優點，近年來得到迅速發展。

建立免疫分析方法，首先必須制備出對農藥特異性強親和力高的抗體。一般農藥的分子量小于1000，不具備刺激機體產生針對農藥抗原決定簇的特異性抗體，為小分子半抗原，因此必須與大分子載體偶聯后才具有免疫原性。要實現與大分子物質的偶聯，半抗原分子上必須具備能共價結合到載體上的一個活性基團(如氨基、羧基、羥基和巰基等)，對多數不具備活性基團的農藥則通常進行衍生化制備或由原料合成，也可以用其他代謝及降解產物作為半抗原。一般理想的半抗原應盡量具備與待測物類似的立體化學特征，以減少免疫交叉污染，而且應盡量保證半抗原與載體的大分子復合物的特征結構能最大限度地被免疫活性細胞所識別。

典型的半抗原結構中應具備適當末端活性基團，如-NH2、-COOH、-OH、-SH等；同時活性基團與載體之間應具備一定長度的間隔臂，一般為4-6個碳鏈長度(0.5-0.8nm)。間隔臂一般為非極性，且除供偶聯的活性基團外，不應有其它高免疫活性的結構，如苯環、雜環等，以降低抗體對間隔臂的識別和間隔臂對待測物結構特征的影響；間隔臂還應遠離待測物的特征結構部分和官能團，有利于高選擇性和高親合性抗體的產生。

半抗原合成以后，通過化學方法使半抗原分子與載體蛋白連接制備免疫原。用作載體的蛋白通常有牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HAS)和鑰孔血藍蛋白(KLH)等。農藥人工抗原合成成功后通常需要經過透析或過柱的方法對其進行純化。對純化后人工抗原進行鑒定，一方面是定性判斷半抗原與載體是否偶聯成功；另一方面是定量測定結合比和蛋白質含量等。判斷是否偶聯成功最簡單的方法為紫外掃描法，如果人工抗原的紫外吸收特征兼具有或不同于原半抗原和載體蛋白的紫外吸收特征，則可初步判斷偶聯成功。

發明內容

本發明目的是建立一種以溴氰菊酯為原料，通過硝化、還原、重氮化、引入羧基活性基團等四步反應合成半抗原方法，以利于制備出對擬除蟲菊酯類農藥特異性強親和力高的抗體。

本發明實施例是這樣實現的，一種對丁二單酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，該合成方法包括：

以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物；

通過重氮化反應，合成半抗原Hp-1；

利用活潑酯法將合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1與載體蛋白BSA相偶聯，制備溴氰菊酯人工免疫抗原。

進一步，以溴氰菊酯為原料，通過硝化還原兩步反應合成溴氰菊酯化合物，合成步驟如下：

向150mL的三口燒瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿攪拌溶解，溶液呈透明黃色，取發煙硝酸10.21mL與16mL乙酸置于恒壓滴液漏斗中充分混勻，緩慢向反應瓶中滴加，1.5h滴加完畢，反應液控制在25℃-30℃范圍內，待滴加完畢，保持該條件繼續攪拌反應3.5h；將反應液倒入200mL的冰水中，攪拌，出現大量淡黃色粘稠物質；用乙酸乙酯對水液進行萃取，然后再用蒸餾水反復洗滌多次，收集有機相，無水Na₂SO₄干燥過夜，抽濾，減壓蒸餾得金黃色粘稠液體。粗產物未經純化，直接進行下一步反應；

稱取上一步得到的產物5g，溶于裝有50mL乙醇的燒瓶中，加入9.8gSnCl₂·2H₂O，攪拌得白色的濁液，反應體系用N2保護，70℃-75℃下反應35min。反應液冷卻后，倒入150mL?H₂O中，攪拌，乳白色漿狀，加入200mL乙酸乙酯，并用10％的NaHCO₃溶液調節pH＝7，過程中溶液產生大量的氣泡，隨后加入適量的硅藻土，抽濾，再用蒸餾水和乙酸乙酯洗滌濾餅，收集濾液中的有機相，無水Na₂SO₄干燥，溶液逐漸由黃色變為紅棕色溶液，抽濾，減壓蒸餾除去溶劑得紅褐色的油狀物。粗產物通過硅膠柱層析，乙酸乙酯/石油醚＝1∶2，脫色純化得淡黃色粘稠物，下一步進行重氮化反應。

進一步，通過重氮化反應，合成半抗原Hp-1，合成步驟如下：

在半抗原Hp-1的基礎上引入羧基活性基團，并加入連接臂；