[發明專利]一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法

有效

• 申請號: 201210292958.3
• 申請日: 2012-08-16
• 公開（公告）號: CN102796761A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 王潔華;籍燕;昝艷君;楊少輝;宋英今
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征是包括如下步驟：

（1）預培養：

歐美雜種山楊在1/2MS培養基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長狀態良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養基中于22-24℃、80-100rpm暗培養1-2d；

（2）農桿菌的培養：

①攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固體培養基上于28℃劃線暗培養2-3d；

②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB液體培養基中于28℃、150-200rpm暗培養24h，至OD₆₀₀為0.6-0.8；

③將步驟②獲得的菌液在3000-4000rpm離心8-10min，棄去上清液，用含有100μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養基重懸菌體至OD₆₀₀為0.4-0.5，于28℃、80-100rpm繼續培養0.5-1h，得到侵染液；

（3）共培養與芽的誘導：

①將預培養后的外植體浸于侵染液中，于22-24℃、80-100rpm培養0.5-2h，轉移至含有100μΜ乙酰丁香酮的MS1固體培養基上，于22-24℃黑暗共培養2d；

②將共培養后的外植體用滅菌的300-400mg/L頭孢霉素水溶液清洗2-3次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS1固體培養基在22-24℃，培養至長出不定芽，在第1-7天，光照強度為400-600lux，16h/d；在第8天開始，光照強度為1500-2000lux，16h/d，每14d更換一次培養基；

（4）芽的伸長：

將帶有不定芽的外植體轉至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養基上誘導芽伸長至3-5cm；

（5）根的誘導：

將伸長的芽轉入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養基上誘導生根。

2.根據權利要求1所述的一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征在于步驟（1）中所述1/2MS培養基包括：MS鹽2.2g/L，蔗糖25-30g/L，pH=5.6-5.8，瓊脂7.0-7.2g/L。

3.根據權利要求1所述的一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征在于步驟（1）中所述MS液體培養基包括：MS鹽4.4g/L，蔗糖25-30g/L，生長素NAA1.86mg/L，細胞分裂素2ip?1.02mg/L，pH=5.6-5.8。

4.根據權利要求1所述的一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征在于步驟（2）中所述YEB固體培養基包括：牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO₄.7H₂O?0.5g/L，瓊脂15g/L，pH=7.0。

5.根據權利要求1所述的一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征在于步驟（2）中所述YEB液體培養基包括：牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO₄.7H₂O?0.5g/L，pH=7.0。

6.根據權利要求1所述的一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征在于步驟（3）中所述MS1固體培養基包括：MS鹽4.4g/L，蔗糖20-30g/L，生長素IBA?0.1mg/L，細胞分裂素BAP?0.2mg/L，細胞分裂素TDZ?0.001mg/L?pH=5.6-5.8，瓊脂7.0-7.2g/L。

7.根據權利要求1所述的一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，其特征在于步驟（4）中所述MS2固體培養基包括：MS鹽4.4g/L，蔗糖20-30g/L，生長素IBA?0.1mg/L，細胞分裂素BAP?0.2mg/L，pH=5.6-5.8，瓊脂7.0-7.2g/L。