[發明專利]一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法

有效

• 申請號: 201210292958.3
• 申請日: 2012-08-16
• 公開（公告）號: CN102796761A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 王潔華;籍燕;昝艷君;楊少輝;宋英今
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域。

背景技術

楊樹屬于楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus?L.)，屬下共分白楊派、大葉楊派、青楊派、黑楊派、胡楊派5派。全世界約有楊樹百余種，其自然分布主要是在北半球的溫帶和寒帶。我國有楊樹53種，主要分布在西南，西北，東北及華北地區。楊樹基因組較小（約為450～550Mbp）,僅為擬南芥基因組的4倍，易于農桿菌介導遺傳轉化，種間可雜交，被認為是林木生物技術的模式樹種。

楊屬白楊派又分兩個亞派：白楊亞派和山楊亞派。白楊亞派包括新疆楊（P.bolleana）（銀白楊變種）、銀灰楊（P.canescens）、毛白楊（P.tomentosa）；山楊亞派包括歐洲山楊（P.tremula?L）、美洲山楊（P.tremuloides）、中國山楊（P.devidiana）和響葉楊（P.adenopoda）；歐美雜種山楊是歐洲山楊和北美山楊的雜交種，具有生長快、樹形高大、材性好等特點；另外該樹種材色淺，材質較軟、細密、樹干端直，是造紙、制備膠合板和刨花板等的優質原料。

但是楊樹屬于多年生樹種，要在短時間內通過常規育種培育出楊樹新品種是很困難的，且通過傳統的楊樹育種方法己遠遠不能滿足現代育種的要求，所以利用組織培養技術和基因工程方法來培育抗逆楊樹新品種對楊樹育種具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種歐美雜種山楊的農桿菌介導轉基因方法，包括如下步驟：

（1）預培養：

歐美雜種山楊在1/2MS培養基上繼代繁殖得到組培苗；選取生長狀態良好的組培苗上帶有部分葉片的葉柄作為外植體，將所述外植體置于MS液體培養基中于22-24℃、80-100rpm暗培養1-2d；

（2）農桿菌的培養：

①攜帶雙元載體pMP90、pBI121的農桿菌C58在含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固體培養基上于28℃劃線暗培養2-3d；

②挑單菌落接種到含有30mg/L慶大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB液體培養基中于28℃、150-200rpm暗培養24h，至OD₆₀₀為0.6-0.8；

③將步驟②獲得的菌液在3000-4000rpm離心8-10min，棄去上清液，用含有100μΜ乙酰丁香酮的MS液體培養基重懸菌體至OD₆₀₀為0.4-0.5，于28℃、80-100rpm繼續培養0.5-1h，得到侵染液；

（3）共培養與芽的誘導：

①將預培養后的外植體浸于侵染液中，于22-24℃、80-100rpm培養0.5-2h，轉移至含有100μΜ乙酰丁香酮的MS1固體培養基上，于22-24℃黑暗共培養2d；

②將共培養后的外植體用滅菌的300-400mg/L頭孢霉素水溶液清洗2-3次，再置于含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS1固體培養基在22-24℃，培養至長出不定芽，在第1-7天，光照強度為400-600lux，16h/d；在第8天開始，光照強度為1500-2000lux，16h/d，每14d更換一次培養基；

（4）芽的伸長：

將帶有不定芽的外植體轉至含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固體培養基上誘導芽伸長至3-5cm；

（5）根的誘導：

將伸長的芽轉入含有350mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培養基上誘導生根。

步驟（1）中所述1/2MS培養基包括：MS鹽2.2g/L，蔗糖25-30g/L，pH=5.6-5.8，瓊脂7.0-7.2g/L。

步驟（1）中所述MS液體培養基包括：MS鹽4.4g/L，蔗糖25-30g/L，生長素NAA1.86mg/L，細胞分裂素2ip1.02mg/L，pH=5.6-5.8。

步驟（2）中所述YEB固體培養基包括：牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO₄.7H₂O0.5g/L，瓊脂15g/L，pH=7.0。