[發明專利]PCR-焦磷酸法檢測單增李斯特菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201210291128.9
• 申請日: 2012-08-15
• 公開（公告）號: CN102827931A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 許龍巖;袁慕云;凌莉;陽靜;唐勤;陳碧玲;易敏英
• 申請（專利權）人: 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及PCR-焦磷酸法檢測單增李斯特菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。

背景技術：

單核細胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes，LMO)，簡稱單增李斯特菌，是一種重要的食源性致病菌，能引起人和動物的李斯特菌病，臨床表現為人和動物腦膜炎，敗血癥及孕婦流產、熱性胃腸炎等，且死亡率極高，可達30%以上。隨著分子生物學的發展，已有用普通PCR或熒光PCR檢測VP的報道，雖然這些方法可達到快速、高通量的目的，但卻無法獲得分子診斷的黃金標準-基因序列，因此有出現假陽性的可能。焦磷酸測序（pyrosequencing）技術是近年來發明的一項實時地進行短片段DNA測序技術，該技術在DNA序列分析時不需要電泳和熒光標記，直接測定測序引物后面的堿基序列，通過提供可靠的序列信息來確認PCR產物，同時由于主要分析PCR產物雙鏈中的一條鏈的序列，避免了由于DNA鏈的二級結構造成的人工假象，使測序結果更加準確。

發明內容：

本發明的目的是提供簡便、快捷、準確性高、特異性強的PCR-焦磷酸法檢測單增李斯特菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。

本發明根據單增李斯特菌LMO溶血素基因hly(GenBank:DQ054589)，設計擴增引物和測序引物，建立了結合PCR-焦磷酸測序檢測LMO的方法，達到從DNA堿基序列水平上快速、準確檢測單增李斯特菌LMO的目的，從而實現了本發明的目的。

本發明的PCR-焦磷酸法檢測單增李斯特菌的檢測引物，其特征在于，包括PCR引物和測序引物：

PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；（如SEQ?ID?NO.1所示）

?????????下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；（如SEQ?ID?NO.2所示）

測序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT（如SEQ?ID?NO.3所示）。

本發明的第二個目的是提供PCR-焦磷酸法檢測單增李斯特菌的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試劑，PCR引物和測序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為：

PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；（如SEQ?ID?NO.1所示）

?????????下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；（如SEQ?ID?NO.2所示）

測序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT（如SEQ?ID?NO.3所示）。

本發明的第三個目的是提供非診斷目的的PCR-焦磷酸法檢測單增李斯特菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；

（2）使用上述PCR引物進行PCR反應，回收PCR產物，制備單鏈模版，然后應用上述測序引物對PCR產物進行焦磷酸測序，自測序引物3^/端后的第一個堿基開始測序，測序引物后的21個DNA堿基序列為ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG時，判斷樣品中含有單增李斯特菌。

優選，所述的PCR反應，其擴增體系50μL，PCR?Mix?Buffer?25μl，Taq酶5μl，MgCl₂?1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去離子水14μl，所述的PCR反應條件為預變性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43個循環；72℃12min。