[發(fā)明專利]PCR-焦磷酸法檢測(cè)單增李斯特菌的檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210291128.9
• 申請(qǐng)日: 2012-08-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102827931A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許龍巖;袁慕云;凌莉;陽(yáng)靜;唐勤;陳碧玲;易敏英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種PCR-焦磷酸法檢測(cè)單增李斯特菌的檢測(cè)引物，其特征在于，包括PCR引物和測(cè)序引物：

PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；

?????????下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；

測(cè)序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT。

2.一種PCR-焦磷酸法檢測(cè)單增李斯特菌的檢測(cè)試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應(yīng)試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測(cè)序試劑，PCR引物和測(cè)序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測(cè)序引物為：

PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；

?????????下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；

測(cè)序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT。

3.一種非診斷目的的PCR-焦磷酸法檢測(cè)單增李斯特菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；

（2）使用權(quán)利要求1所述的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR產(chǎn)物，制備單鏈模版，然后應(yīng)用權(quán)利要求1所述的測(cè)序引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，自測(cè)序引物3^/端后的第一個(gè)堿基開(kāi)始測(cè)序，測(cè)序引物后的21個(gè)DNA堿基序列為

ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG時(shí)，判斷樣品中含有單增李斯特菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增體系50μL，PCR?Mix?Buffer?25μl，Taq酶5μl，MgCl₂?1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去離子水14μl，所述的PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43個(gè)循環(huán)；72℃12min。