[發明專利]甜菊雙苷轉化為萊鮑迪苷B的方法

有效

• 申請號: 201210288781.X
• 申請日: 2012-08-14
• 公開（公告）號: CN102796790A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 李沁桐;歐陽勁
• 申請（專利權）人: 成都南諾格生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12R1/685
• 代理公司: 成都華典專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 徐豐;楊保剛

技術領域

本發明屬于食品化工領域，具體涉及一種甜菊雙苷轉化為萊鮑迪苷B的方法。?

背景技術

甜菊糖苷(Steviol?glycosides)是對甜葉菊提取物的一個總稱，其甜味成分包括甜菊苷（Stevioside），萊鮑迪苷A、B、C、D、E（Rebaudi?oside?A/B/C/D/E），甜菊單苷（Steviolmonoside），甜菊雙苷（Steviolbioside），杜克苷A（Dulcoside?A）等，甜菊糖苷成分的結構式如下：?

萊鮑迪苷B（Rebaudioside?B，以下簡稱RB）是甜菊糖苷中甜味成分之一，?研究發現其除有較強的甜度外，還有降血脂的生理功效，是新一代功能性甜味劑。但是RB在甜菊糖苷中的含量小于1%，如果通過純化甜菊糖苷來生產RB，其成本很高，難以大量生產和推廣使用。?

目前對于甜菊糖苷生物轉化的研究多集中在已有分子上加入長糖鏈。?

專利申請CN?201110379733.7公開了一種用β-環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)提高甜菊糖苷味質的方法，其特征在于：用水配制成含2-5％重量的甜菊糖苷和2-5％重量的淀粉的反應液，將酶活為60-70U/ml的β-環糊精葡萄糖基轉移酶加入反應液中充分混合均勻，轉移酶的加入量為300-500U/甜菊糖苷重量g，在溫度為37-50℃進行轉化反應48-72小時。?

專利申請201010131126.4公開了種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法。該方法以甜菊糖水溶液和淀粉水解液為原料，在微波反應裝置中經由微波輻射與CGTase催化的共同作用合成葡萄糖基取代的甜菊糖苷。在本發明提供的工藝條件內，不僅可以顯著加快酶催化反應的進行，而且不會產生通常條件下水體系中微波使酶失活的現象。?

以上這些方法都是用環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷，但CGTase不能將單一的一個葡萄糖殘基加到甜菊糖苷分子上，并且其催化糖鏈轉移到甜菊糖苷上的位置不專一。因此，CGTase的催化產物是復雜的混合物，難以符合美國FDA和歐盟JECFA的標準。?

迄今為止，還沒有以甜菊雙苷為原料，通過微生物發酵，以蔗糖為糖基供體進行生物轉化生產萊鮑迪苷B的報道。?

發明內容

本發明所解決的技術問題是提供一種以甜菊雙苷為原料，以蔗糖為糖源，通過酶法轉化生產萊鮑迪苷B，從而改善其口感的方法。?

本發明的技術方案為：甜菊雙苷轉化為萊鮑迪苷B的方法，其以甜菊雙苷為原料，以蔗糖為糖源，在黑曲酶Ⅲ的催化下轉化為萊鮑迪苷B。?

進一步地，轉化的方法包括以下步驟：?

（1）以重量計，將1份甜菊雙苷和4～8份蔗糖溶解入水中配制成水溶液。?

（2）向步驟（1）得到的水溶液中加入黑曲酶Ⅲ，添加量按重量計為：甜菊雙苷︰黑曲酶Ⅲ=1200～1800︰1，優選為1600︰1，然后在一定條件下反應。?

（3）反應完成，過濾反應液，干燥即得含有萊鮑迪苷B的固形物。?

進一步地，步驟（1）中加水量為20～40重量份。?

進一步地，步驟（2）中反應的條件為：溫度30～50度，pH6～8，反應時間為3～7小時。?

本發明轉化方法的關鍵之處在于：蔗糖作為糖供體，由黑曲酶Ⅲ作為催化劑將甜菊雙苷轉化為萊鮑迪苷B。?

蔗糖作為原料之一，由于其物理化學性質與甜菊單糖苷差異較大，故反應后還可以采用柱層析和結晶等方式去除未反應的蔗糖以及反應后的果糖。當固形物中去除了蔗糖、果糖、黑曲酶Ⅲ后，固形物中萊鮑迪苷B含量可大于80%，甚至可大于90%。?

作為本發明轉化方法中的關鍵因子黑曲酶Ⅲ，它是從黑曲霉菌CICC?40417（中國工業微生物菌種保藏管理中心保藏編號：40417）發酵誘導得到的一種特異性糖基轉移酶。具體的，它是利用下述方法得到的：?

（1）挑取黑曲霉菌CICC?40417單克隆，接種至含25ml?BMGY培養液的250ml搖瓶中，26-30度，200-300rpm培養至OD600=2-6(約16-18小時)。將25ml培養基接種至含1L?BMGY培養液的2-4L搖瓶中，26-30度劇烈振蕩(200-300rpm)，至對數生長期(OD600=2-6)。?