[發明專利]一種亮斑扁角水虻抗菌肽及制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210286878.7
• 申請日: 2012-08-13
• 公開（公告）號: CN102816769A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 張吉斌;周定中;王茂淋;左懷雨;喻子牛
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A61P31/10;A23K1/17;A01N47/44;A01P1/00;A01P3/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏峰

技術領域

本發明涉及基因生物工程技術領域。具體涉及一種亮斑扁角水虻（Hermetia?illucens?L.）抗菌肽基因，還涉及一種亮斑扁角水虻抗菌肽的制備方法，還涉及一種亮斑扁角水虻抗菌肽在抗菌功能方面的應用。?

背景技術

昆蟲抗菌肽是當昆蟲在受到意外損傷或病原菌感染時所產生的一類抗菌活性物質，它是生物體內非特異性免疫防御系統中的一種免疫應答產物，主要產生在血血淋巴中，具有多方面的優點，如分子量小、熱穩定性好、廣譜抗菌作用和病原菌不易產生抗性等。?

目前病原微生物的耐藥性不斷增強，耐藥譜也在不斷擴大，因此對臨床抗病、抗感染、農業動植物病害等治療效果影響較為嚴峻。人們在積極進行研究耐藥菌耐藥機制的同時，不斷尋找和研究新的不同于傳統藥物作用機制的抗微生物藥物，由此抗菌肽的相關研究便成了人們關注和研究的熱點。?

美國和日本已經投入巨資進行天然抗菌肽的研究和開發，并把昆蟲資源的開發特別是蠅類資源開發作為高新技術產業之一，但該領域的研究與發展在我國才開始。目前，國內外的專家和學者從雙翅目類昆蟲（主要是蠅類昆蟲）中的果蠅、家蠅、廄螯蠅、地中海實蠅等體內分離得到抗菌肽。這些抗菌肽具有很多較好的特性，如水溶性好、廣譜的抗菌活性、可抑制多種細菌、真菌、病毒及腫瘤癌細胞但不損傷正常的體細胞、無毒副作用等。?

雙翅目昆蟲亮斑扁角水虻能生長在腐物、糞便和垃圾等含有大量細菌的惡劣環境中，其自身卻不會因為感染病原菌而引起死亡，這說明亮斑扁角水虻對病原微生物有很強免疫力（何正波等，2001）。而這種免疫力很可能來自亮斑扁角水虻本身所分泌的活性物質所起作用。?

昆蟲自身免疫產生的抗菌肽的研究已經比較多，尤其是針對于家蠅所產生的抗菌肽研究較多，從早期的昆蟲的活性物質的提取和分離純化到目前階段的用基因工程方法來進行活性肽分子的鑒定與克隆。但在環境安全方面，以亮斑扁角水虻作為研究材料不僅不會傳播病原菌，而且亮斑扁角水虻本身還是處理農業廢棄物的好材料，所以相對其它昆蟲材料用來進行抗菌肽研究會更加安全，具有可行性。亮斑扁角水虻在利用糞便等能分泌抗菌物質，可能有新的抗菌肽基因，有必要對其抗菌肽基因進行篩查，?

因此，對亮斑扁角水虻中發掘新的抗菌肽進行深入研究，對醫藥、食品防腐劑、飼料添?加劑和農作物病害生物防治等諸多領域具有重要的意義。為亮斑扁角水虻抗菌肽功能和作用機制研究提供了分子基礎，并為抗菌肽在生物防治和醫藥中的應用提供理論依據。?

發明內容

本發明的一個目的在于提供了一種新抗菌肽基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示，這兩個核苷酸序列的相似度達到99％（該基因序列中存在堿基突變），與已知的Stomoxyn抗菌肽基因（GeneBank?NO：AP00484）同源性為46.29％，能編碼同一種抗菌肽。該序列是首次從亮斑扁角水虻中篩查克隆得到，可以根據該序列設計引物，并以亮斑扁角水虻的cDNA為模板，通過PCR或RT-PCR的方法大量擴增該核苷酸序列，連接于表達載體，表達生產抗菌肽。?

本發明的另一個目的在于提供了一種新抗菌肽Stomoxyn?ZH1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.3所示。該抗菌肽具有廣譜的抗菌活性：能抗革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌以及抗真菌稻瘟病病原菌；在醫藥、農業病害防治、飼料添加劑等方面有良好的應用前景。?

本發明還有一個目的在于提供了一種新抗菌肽Stomoxyn?ZH1的制備方法，構建真核表達載體，轉化到表達菌株后進行誘導培養，離心取發酵上清，將上清采用冷凍干燥濃縮法獲得目的抗菌肽，該方法簡便，快速且成本低廉。?

本發明還涉及一種新抗菌肽Stomoxyn?ZH1在制備治療或預防醫學抗菌感染等藥物中的應用。?

本發明還涉及一種新抗菌肽Stomoxyn?ZH1在制備商業動物抗菌飼料添加劑的應用。?

本發明還涉及一種新抗菌肽Stomoxyn?ZH1在制備治療或預防農業植物病害的生物農藥中的應用。?

為實現上述任務，本發明采用以下技術措施：?