[發明專利]一種捕獲核酸片段的方法

有效

• 申請號: 201210286589.7
• 申請日: 2012-08-14
• 公開（公告）號: CN102827830A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種捕獲核酸片段的方法。

背景技術

隨著第二代高通量測序技術的出現和發展，目前，科學家們已經能夠對很多生物物種的基因組進行常規的從頭測序，并對這些物種的基因組中的重要部分進行再測序。但是，在廣泛應用的第二代高通量測序技術的成功使用過程中存在一個主要瓶頸：即如何快速有效的將散落于基因組、線粒體和/或其他形式的DNA中的特定區域的核酸片段選擇性的捕獲出來。選擇性捕獲并富集來自生物物種的基因組、線粒體和/或其他形式的DNA的特定區域具有廣泛的應用。

現有技術中主要是通過微陣列技術捕獲特定區域的核酸片段，方法如下：1）在微陣列芯片上通過化學合成直接生成與目的片段互補的DNA片段；2）利用帶T7?promoter的引物對步驟1）所得的DNA片段進行PCR擴增，然后對PCR產物進行逆轉錄，轉錄體系中加入了帶有生物素標記的dUTP，生成帶有生物素標記的RNA片段（捕獲探針）；3）將片段化后的基因組DNA與帶有生物素標記的RNA片段混合孵育，使得目的DNA片段與RNA結合，提取純化得到目的DNA片段。該方法中，帶有生物素標記的RNA片段的生物素標記是在逆轉錄過程中通過帶生物素標記的dUTP引入的，生物素標記的數量和位置是隨機的，捕獲探針的均一性不好，可能導致獲得的捕獲探針中的部分探針上的生物素標記過多和/或位置不當，影響其與基因組DNA的雜交，進而導致對目的DNA片段的捕獲效果不佳；此外，本方案在制備捕獲探針的過程中需要在芯片上化學合成與目的片段互補的DNA片段，生產成本高。

因此，需要一種新的捕獲核酸片段的方法，能夠避免因為捕獲探針的均一性差而導致的捕獲效果不佳的現象的發生，并降低捕獲核酸片段的成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的捕獲核酸片段的方法，旨在解決現有技術中因為捕獲探針的均一性差而導致捕獲效果不佳的問題。

為了實現發明目的，本發明提供了一種捕獲核酸片段的方法，包括以下步驟：

A.以含待捕獲核酸片段的核酸分子為原料，利用生物素標記的擴增引物或接頭元件制備生物素標記的捕獲探針；

B.使生物素標記的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交，利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲所述待捕獲核酸片段。

其中，所述步驟B可包括以下步驟：

B01.利用含鏈霉親和素或親和素標記的固相載體捕獲步驟A中的生物素標記的捕獲探針，得固定在固相載體上的捕獲探針；

B02.使固定在固相載體上的捕獲探針與待捕獲核酸片段庫雜交得第一次雜交產物，分離純化第一次雜交產物得含固相載體的第一產物；

B03.使步驟B02得到的產物變性，得第一次捕獲產物。

進一步的，在所述步驟B03之后還可包括以下步驟：

B04.利用在步驟B01中得到的固定在固相載體上的捕獲探針與步驟B03所得的第一次捕獲產物雜交得第二次雜交產物，分離純化第二次雜交產物得含固相載體的第二產物；

B05.使步驟B04得到的產物變性，得第二次捕獲產物。

上述任一方案中，所述步驟B中的雜交是在周期性震動中進行的。

上述任一方案中，所述含待捕獲核酸片段的核酸分子為克隆載體庫。

其中，所述步驟A可有多種實現方式。

在一種實施方案中，所述步驟A可包括以下步驟：

A01.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板；

A02.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產物；

A03.DNA模板片段化產物與生物素標記的接頭元件連接，得生物素標記的捕獲探針。

在另一種實施方案中，所述步驟A可包括以下步驟：

A11.使用限制性酶將克隆載體庫中的待捕獲核酸片段酶切下來，從而獲得DNA模板；

A12.片段化DNA模板，得DNA模板片段化產物；

A13.DNA模板片段化產物與接頭元件連接，得含接頭的DNA模板片段；

A14.利用生物素標記的擴增引物對步驟A13的產物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。

在另一種實施方案中，所述步驟A包括以下步驟：

A21.片段化含待捕獲核酸片段的核酸分子，得片段化產物；

A22.片段化產物與接頭元件連接，得含接頭的核酸片段；

A23.利用生物素標記的擴增引物對步驟A22的產物進行PCR擴增，得生物素標記的捕獲探針。