[發(fā)明專利]用普魯士藍(lán)平板定量測定L-氨基酸氧化酶活力的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210284618.6
• 申請(qǐng)日: 2012-08-10
• 公開（公告）號(hào): CN102911999A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余志良;周寧;裘娟萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/26
• 分類號(hào): C12Q1/26;C12R1/38
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述方法為：（1）普魯士藍(lán)瓊脂平板的制備：將10~30g/L氯化鐵水溶液與10~30g/L鐵氰化鉀水溶液以體積比0.2~6:1混合制成混合液，然后將混合液與MM瓊脂液以體積比1:5~20混合搖勻，在115℃下滅菌30min，倒平板，制成所述普魯士藍(lán)瓊脂平板；所述MM瓊脂液終濃度組成為：酵母膏0～10g/L、蛋白胨2～20g/L、瓊脂15～30g/L，pH?5～9，溶劑為水；（2）L-氨基酸氧化酶活力的測定：取步驟(1)制得的普魯士藍(lán)瓊脂平板，用打孔器在所述普魯士藍(lán)瓊脂平板上打出直徑為4~10mm的小孔，然后將小孔中加入待測液，室溫靜置10~300min，待測液產(chǎn)生的過氧化氫在所述的小孔周圍形成藍(lán)色圈，測定藍(lán)色圈的直徑，根據(jù)過氧化氫與藍(lán)色圈直徑標(biāo)準(zhǔn)直線來確定過氧化氫釋放量，從而推論得L-氨基酸氧化酶活力；所述的過氧化氫與藍(lán)色圈直徑的標(biāo)準(zhǔn)直線是以所取用步驟(2)同樣的普魯士藍(lán)瓊脂平板以梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)過氧化氫為測試樣品做與待測液平行試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)濃度的過氧化氫與藍(lán)色圈直徑線性關(guān)系圖；所述待測液的制備方法為：以交替假單胞菌B3（Pseudoalteromonas?sp.B3）發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶為酶源，以待測L-氨基酸為底物，25～50℃，pH?5～9條件下反應(yīng)0.5～2h，獲得的反應(yīng)液即為待測液；所述酶來自于交替假單胞菌B3發(fā)酵培養(yǎng)后獲得的含濕菌體發(fā)酵液離心棄去沉淀后獲得的上清液，所述L-氨基酸初始底物濃度為2～20mmol/L，所述上清液用量以含濕菌體發(fā)酵液中濕菌體質(zhì)量計(jì)為0.5～10mg濕菌體/mmol底物；所述L-氨基酸氧化酶活力的定義為：30℃下，1mL酶液作用底物濃度為5mmol/L的L-氨基酸1h后釋放出1mmol/L過氧化氫即為1個(gè)酶活單位（U）。

2.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述氯化鐵水溶液的質(zhì)量濃度均為15~25g/L，所述鐵氰化鉀水溶液的質(zhì)量濃度為15~25g/L。

3.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述氯化鐵水溶液和鐵氰化鉀水溶液的體積配比為0.4~2.5:1，所述氯化鐵水溶液和鐵氰化鉀水溶液的混合液與MM瓊脂液體積配比為1:7~15。

4.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述MM瓊脂液終濃度組成為：酵母膏2～5g/L、蛋白胨3～7g/L、瓊脂18～25g/L，pH?6～8，溶劑為水。

5.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述打孔器打出小孔的直徑為5~7mm。

6.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述每孔中加入的待測液為30～70μL。

7.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述小孔加入待測液后室溫靜置15~60min。

8.如權(quán)利要求1所述利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法，其特征在于所述L-氨基酸為L-亮氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-胱氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬酰胺、L-高苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯甘氨醇或L-纈氨酸。