[發(fā)明專利]用普魯士藍(lán)平板定量測定L-氨基酸氧化酶活力的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210284618.6
• 申請日: 2012-08-10
• 公開（公告）號: CN102911999A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余志良;周寧;裘娟萍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12R1/38
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及L-氨基酸氧化酶活力測試方法，特別涉及一種利用普魯士藍(lán)瓊脂平板定量檢測L-氨基酸氧化酶活力的方法。?

（二）背景技術(shù)

L-氨基酸氧化酶(L-amino?acid?oxidase,簡稱LAAO，酶學(xué)編號為：EC1.4.3.2)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或單核苷酸(FMN)為輔基的黃素蛋白酶。此酶能夠特異性催化L-氨基酸的氧化脫氨生成α-酮酸、氨和過氧化氫。因此，它能被應(yīng)用于L-氨基酸定量分析、LD-氨基酸的拆分和α-酮酸的制備。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道了LAAO本身具有抗菌、殺蟲、抗病毒等生物活性，還具有與血小板相互作用、細(xì)胞毒性及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有極其廣闊的應(yīng)用前景。?

LAAO被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于微生物、蛇毒、魚的表皮粘液、老鼠、海兔子等多種生物體中。目前檢測LAAO活性的常用方法有2種，即熒光法和分光光度法。這2種方法均是依據(jù)測定由LAAO催化底物所生成的H₂O₂變化量來實(shí)現(xiàn)的。熒光法是依據(jù)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H₂O₂可使無熒光性的高香草酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛袕?qiáng)烈熒光的物質(zhì)，根據(jù)反應(yīng)體系熒光值的變化來測定LAAO酶活。此方法雖然測定精確度、靈敏度都較高，但熒光壽命短，容易淬滅，操作時(shí)需避免長時(shí)間暴露于光和空氣中，而且蛋白質(zhì)中某些氨基酸對其干擾較大。分光光度法是依據(jù)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H₂O₂可作用于色素原物質(zhì)而使其在一定波長下產(chǎn)生吸光值，根據(jù)反應(yīng)體系吸光值的變化來測定LAAO酶活。此方法對設(shè)備要求低，反應(yīng)快，操作簡單，重復(fù)性好，且價(jià)格便宜，具有明顯的優(yōu)勢，因此分光光度法是目前測定LAAO活性的最常用方法。MacHeroux等（MacHeroux?P,Seth?O,Bollschweiler?C,et?al.?L-Amino?acid?oxidase?from?the?Malayan?pit?viper?Calloselasma?rhodostoma.Comparative?sequence?analysis?and?charaterization?of?active?and?inactive?forms?ofthe?enzyme.Eur?J?Biochem,2001,268:1679-1686.）以鄰聯(lián)茴香胺（ODA）為偶聯(lián)探針，用分光光度法測定不同蛇毒LAAO的活性。結(jié)果表明，測定方法具有較好的穩(wěn)定性。陳洲等（陳洲,黃劍鈞,薛玲,等.眼鏡蛇毒L-氨基酸氧化酶活性檢測方法的優(yōu)化.海峽藥學(xué),2009,21(5):29-31.）采用鄰聯(lián)茴香胺、鄰苯二胺(OPD)和3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)三種供氫體測定LAAO的活性并比較其靈敏度和重復(fù)性，結(jié)果表明鄰苯二胺方法測定LAAO酶活性具有較好的靈敏度和穩(wěn)定性。以上的這些方法主要是用來定性地檢測LAAO，而建立一種既簡單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定和靈敏，又能定性并定量檢測LAAO活力的方法，將具有極重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前，定性及定量檢測LAAO的方法主要是商品化的H₂O₂檢測試劑盒，如美國Invitrogen公司的Amplex?Red?Hydrogen?Peroxide/Peroxidase?Assay?kit。發(fā)明專利（余志良、喬華、裘娟萍.交替假單胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的應(yīng)用.申請?zhí)枺?01110336029.3；申請日期：2011-10-28.）也用Amplex?Red?Hydrogen?Peroxide/Peroxidase?Assay?kit試劑盒篩選到一株產(chǎn)LAAO的交替假單胞菌B3（菌種保藏號為：CGMCC?NO.5353）。雖然，該試劑盒比較靈敏、穩(wěn)定，被廣泛使用，但是，其對設(shè)備要求高，操作復(fù)雜，價(jià)格極其昂貴（每個(gè)反應(yīng)大約要幾十元人民幣）。?