[發明專利]一種登革病毒/黃熱病毒/西尼羅病毒/基孔肯雅病毒鑒別檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210282195.4
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102776297A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 李明;鄭夔;高秀潔;陳華云;丁國允;黃吉城;李小波;師永霞
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司;廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種登革病毒/黃熱病毒/西尼羅病毒/基孔肯雅病毒鑒別檢測試劑盒，包括：1)RT-PCR反應液、引物探針混合液、RT-PCR反應酶系、DEPC?H₂O，陰性質控品、陽性質控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中引物探針混合液由一對登革病毒特異性的正、反向引物，一對黃熱病毒特異性的正、反向引物，一對西尼羅病毒特異性的正、反向引物，一對基孔肯雅病毒特異性的正、反向引物，一條登革病毒特異性的探針，一條黃熱病毒特異性的探針，一條西尼羅病毒特異性的探針，一條基孔肯雅病毒特異性的探針組成，其特征在于：

登革病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-GATTCTCAAAAGGATTGCTCTC-3’和5’-TTGTTAGGAATGCTATGAAGGC-3’，登革病毒特異性的探針的序列是5’-catca+Cca+Att+Tca+Tgg+Gtc-3’(堿基前含“+”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結合有熒光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQ1；該對引物探針可檢測登革病毒所有亞型，包括I型、II型、III型及IV型；

黃熱病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-AAACAAAACAAATTGGAAACAG-3’，和5’-TTTTCCAGTCAAAATGTTGAAC-3’黃熱病毒特異性的探針的序列是5’-cttg+Aac+Acc+Tct+tgA+agG+Tcc-3’(堿基前含“+”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結合有熒光發生基團Cy5和熒光淬滅基團Eclipse；

西尼羅病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-CCGCCACCGGAAGTTGA-3’和5’-CGAGACGGTTCTGAGGGCT-3’，西尼羅病毒特異性的探針的序列是5’-caa+Cccc+Agga+Ggact-3’(堿基前含“+”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結合有熒光發生基團HEX和熒光淬滅基團Eclipse。

基孔肯雅病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-GTGGGAGTACCGTATAAGACTC-3’和5’-CAGACAGAAGCTCCATCTCC-3’，基孔肯雅病毒特異性的探針的序列是5’-cta+Cag+Ccc+Cat+Ggt+Act-3’(堿基前含“+”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結合有熒光發生基團Texas?Red和熒光淬滅基團Eclipse。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于所用探針采用特殊LNA標記。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于引物探針混合液中引物濃度均為0.2mmol/L，探針濃度均為0.1mmol/L。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于RT-PCR反應液由pH值為8.0的50mmol/LTris-HCl、8mmol/L?MgCl₂、250mmol/L?KCl組成。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其中RT-PCR反應酶系由熱啟動Taq酶、逆轉錄酶、dNTPs組成，特征在于每人份RT-PCR反應酶系中熱啟動Taq酶的用量為5U，逆轉錄酶用量為5U，dNTPs為10mmol。

6.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴增的條件為：50℃?15分鐘，95℃?15分鐘；94℃?15秒，55℃?45秒，40個循環；40℃?10秒。

7.根據權利要求1的試劑盒，還提供了陰性質控品和陽性質控品，其特征在于陰性質控品為生理鹽水，陽性質控品為含有登革、黃熱、西尼羅、基孔肯雅這四種病毒核酸的DEPC?H₂O溶液，由四種病毒陽性核酸按照濃度為1.0×10⁵copies/mL濃度等體積比混合而成。