[發(fā)明專利]一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動(dòng)物的試紙條及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210281588.3
• 申請(qǐng)日: 2012-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN102818898A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張改平;楊蘇珍;盧清俠;職愛民;楊繼飛;喬松林;鄧瑞廣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 鄭州金成知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)口蹄疫病毒的器具，特別是涉及一種快速鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動(dòng)物的試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)

口蹄疫（Foot-and-mouth-disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄動(dòng)物的一種烈性傳染性疫病。FMDV?具有多型性、易變性、宿主廣泛性、傳染力極強(qiáng)等特點(diǎn)，一旦發(fā)病即呈流行性、大爆發(fā)性。FMD?的爆發(fā)和流行常給發(fā)病地區(qū)造成巨大損失，除動(dòng)物死亡造成的直接經(jīng)濟(jì)損失外，還有動(dòng)物患病期間肉和奶的生產(chǎn)停滯、病愈后肉和奶的產(chǎn)量長期下降以及種用價(jià)值喪失等較大損失。更為嚴(yán)重的是，F(xiàn)MD?是一種烈性傳染病，具有極強(qiáng)的傳染性，對(duì)于發(fā)病動(dòng)物以及接觸病原的同群動(dòng)物，必需進(jìn)行嚴(yán)格隔離、封鎖、禁止動(dòng)物移動(dòng)和畜產(chǎn)品上市等。因此，F(xiàn)MD導(dǎo)致發(fā)病地區(qū)甚至發(fā)病國家的畜產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易停止，除造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失外，還產(chǎn)生一定的政治影響。

疫苗接種是發(fā)展中國家控制FMD?的主要策略，由于FMD?固有的特點(diǎn)，目前國內(nèi)外的疫苗只能保護(hù)免疫動(dòng)物不發(fā)生FMD，但是這種方法不能防止免疫動(dòng)物再次發(fā)生FMDV?的感染。在疫區(qū)的免疫動(dòng)物群中，有一定數(shù)量的動(dòng)物是病毒攜帶者，這些動(dòng)物有可能持續(xù)向外排毒，在牛、羊體內(nèi)形成持續(xù)性感染的病毒可長期存在。這些隱性感染或帶毒的動(dòng)物不但可能引發(fā)新的疫情，還為病毒變異和產(chǎn)生新毒株提供了環(huán)境。因此，F(xiàn)MDV疫苗免疫動(dòng)物抗體水平以及如何區(qū)分免疫動(dòng)物和病毒感染動(dòng)物是控制FMDV?的關(guān)鍵問題。

目前使用的FMDV?疫苗主要是滅活疫苗和合成肽疫苗。滅活疫苗免疫動(dòng)物后，動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)有病毒增殖，疫苗生產(chǎn)中在病毒純化過程中已經(jīng)去除了絕大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP），沒有了非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，因而在免疫動(dòng)物體內(nèi)就不會(huì)有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的產(chǎn)生，多肽疫苗本身就是FMDV?結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的一個(gè)主要抗原表位，更沒有非結(jié)構(gòu)蛋白的存在。而FMDV?感染的動(dòng)物體內(nèi)，在病毒裝配過程中有大量非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的非機(jī)構(gòu)蛋白抗體。結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)可以監(jiān)控動(dòng)物的免疫狀態(tài)和抗體產(chǎn)生水平，非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)技術(shù)為區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物提供依據(jù)，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合可以達(dá)到一步檢測(cè)FMDV免疫抗體水平以及區(qū)分FMDV感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的目的。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)FMDV抗體的方法有：（1）病毒分離：從患病動(dòng)物的病料中分離出病毒，再對(duì)分離到的病毒進(jìn)行培養(yǎng)鑒定做出診斷，確定是否FMDV?感染。這種技術(shù)準(zhǔn)確可靠，但敏感性差，而且有些樣品中存在補(bǔ)體活性，影響檢測(cè)效果，并且需要專門的實(shí)驗(yàn)室。（2）病毒中和試驗(yàn)：利用病毒與特異性血清中和抗體的相互作用，從而使病毒失去對(duì)易感動(dòng)物和敏感細(xì)胞的感染能力，這一方法必須使用活病毒，普通實(shí)驗(yàn)室不能操作。（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：主要有區(qū)分感染與免疫的非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA（I-ELISA）和檢測(cè)疫苗免疫動(dòng)物的血清抗體水平的液相阻斷ELISA。ELISA方法測(cè)定時(shí)具有特異、敏感等優(yōu)勢(shì)，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要特定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，很難在基層普及推廣。同時(shí)，液相阻斷ELISA方法需要滅活病毒的參與，因此，還存在病毒滅活不全或病毒逃逸等風(fēng)險(xiǎn)。此外，近年來隨著豬O型FMD合成肽疫苗的推廣應(yīng)用，已經(jīng)逐步占據(jù)了主要市場(chǎng)，傳統(tǒng)的液相阻斷ELISA很難對(duì)多肽疫苗抗體做出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。因此，研究一種簡便快速、一步可以檢測(cè)疫苗免疫和病毒感染的實(shí)時(shí)在線檢測(cè)技術(shù)，非常重要而迫切。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體存在的缺陷，提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便、快速鑒別口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體的免疫金標(biāo)試紙條，該試紙條具有特異性強(qiáng)、敏感性高、使用簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)；

本發(fā)明還提供了鑒別口蹄疫病毒抗體和疫苗抗體的免疫金標(biāo)試紙條的制備方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動(dòng)物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測(cè)試端依次為樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡，所述金標(biāo)抗體纖維層上吸附有膠體金標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測(cè)印跡用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化的豬口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對(duì)照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。

所述支撐層用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成；樣品吸附纖維層用玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成；金標(biāo)抗體纖維層用玻璃棉制成。