[發明專利]一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條及其制備方法

有效

• 申請號: 201210281588.3
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102818898A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 張改平;楊蘇珍;盧清俠;職愛民;楊繼飛;喬松林;鄧瑞廣
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 鄭州金成知識產權事務所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

1.一步鑒別口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動物的試紙條，含有支撐層和吸附層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測印跡和對照印跡，其特征是：所述金標抗體纖維層上吸附有膠體金標記的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述檢測印跡用大腸桿菌表達系統表達并純化的豬口蹄疫病毒結構蛋白VP1抗原和非結構蛋白3ABC抗原中的一種或兩種印制，對照印跡用羊或兔抗SPA的IgG抗體印制。

2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是：所述支撐層用不吸水的硬質塑膠條或硬紙條制成；樣品吸附纖維層用玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成；金標抗體纖維層用玻璃棉制成。

3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是：所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、纖維素膜、羧甲基纖維素膜或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。

4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是：所述纖維素膜層上含有一條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“｜｜”、“十十”、“┬?┬”、“┴?┴”、“├├”、“┤┤”和“●?●”中的任一種；纖維素膜層上含有兩條/個檢測印跡時，檢測印跡、對照印跡的排列形式為“｜｜｜”、“十十十”、“┬?┬?┬”、“┴?┴?┴”、“├├├”、“┤┤┤”和“●?●?●”中的任一種。

5.根據權利要求1～4任一項所述的試紙條，其特征是：在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線。

6.權利要求1所述試紙條的制備方法，其特征是：該方法包括以下步驟：

（1）大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結構蛋白VP1抗原和非結構蛋白3ABC抗原的制備；

（2）膠體金標記的葡萄球菌蛋白A的制備：以檸檬酸鈉還原法制備膠體金，進而獲得膠體金標記的SPA；

（3）羊抗或兔抗SPA的IgG抗體的制備：

用所得的大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結構蛋白VP1抗原和非結構蛋白3ABC抗原中的一種或兩種分別在纖維素膜層上制成檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制成對照印跡；將膠體金標記的葡萄球菌蛋白A用于制備金標抗體纖維層，然后將支撐層、吸附層和保護層依次組裝成試紙條。

7.根據權利要求6所述試紙條的制備方法，其特征是：其中大腸桿菌表達并純化的豬口蹄疫病毒結構蛋白VP1抗原的制備方法如下：

根據O?型FMDV?VP1模板基因序列設計一對特異性引物：上游引物5’ATAGGATCCA

TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’?引入酶切位點BamHI，下游引物5’ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位點HindIII；以重組質粒pMD18T-VP1?為模板，進行PCR?擴增，獲得VP1?基因；PCR?產物經BamHI?和HindIII?雙酶切消化克隆到PET-28a?載體中，轉化大腸桿菌，將重組菌在LB培養基中培養至OD600?達到0.6?時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導劑，使其濃度為0.5mmol/L，在37℃誘導表達6小時，將表達菌液離心，收獲細菌沉淀；

將得到的菌體重懸于20毫升緩沖液中，超聲破碎后離心收集沉淀，用洗液洗滌包涵體5次，將沉淀懸于20毫升懸浮液中洗滌1次，最后離心沉淀得到純化后的包涵體；將純化后的包涵體溶于pH為?8.0的變性劑中，于4℃攪拌10小時，離心去除不溶物，得到變性蛋白；取90毫升變性蛋白裝入透析袋，并將透析袋放入1.8升復性緩沖液中，4℃條件下攪拌透析，每5小時換液一次，換液4次后用1.8升?PBS透析4次，前兩次透析12小時/次，后兩次透析6小時/次；收集透析袋內的液體，經10000轉/分鐘、4℃?離心10分鐘，棄去沉淀，將上清用0.45微米濾膜過濾；用20KD?的濃縮管濃縮，3000轉/分鐘、4℃離心30分鐘，收集濃縮蛋白，于-20℃冷凍保存。