[發明專利]一種α-淀粉酶及其應用

有效

• 申請號: 201210281532.8
• 申請日: 2012-08-08
• 公開（公告）號: CN102827816A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 王華明;林艷梅
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/30
• 分類號: C12N9/30;C12N15/56;C12N15/80;C12N1/15;A21D8/04;C12R1/80;C12R1/685
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;曾慶國

技術領域

本發明屬于酶基因工程技術領域，具體涉及一種α-淀粉酶及其應用。

背景技術

真菌來源的α-淀粉酶可以粗略的按酶學性質或作用條件分為3種類型：中性真菌α-淀粉酶、耐酸或耐熱性真菌α-淀粉酶、具有生淀粉酶活力的真菌α-淀粉酶。α-淀粉酶是重要的工業用酶，其被用于生產產品諸如高麥芽糖漿、焙烤制品。在啤酒釀制行業（提高麥芽汁的可發酵性）、黃酒釀制行業（改善酒質，提高出酒率）以及低聚異麥芽糖生產等行業均有不同程度的應用。

已報道有多種真菌α-淀粉酶基因在不同宿主中得到表達,其中真菌α-淀粉酶基因的異源表達主要集中在真核表達系統,盡管絕大多數報道中異源表達真菌α-淀粉酶的表達水平不高,但異源表達是實現真菌α-淀粉酶單一酶活的最好途徑。

我國在真菌α-淀粉酶的研究方面雖然開展較晚，但研究成果對提升我國酶制劑工業有積極意義。與其它淀粉水解酶系的研究水平相比，我國真菌α-淀粉酶的研究水平不高，所有研究幾乎沒有涉及基因的克隆與表達，發酵生產方式也未從固態發酵向液體發酵轉變，發酵生產水平與國際先進水平也存在較大差距。酶制劑產品為多種α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷酶的混合產品，往往無法有效的進行目的產物的生成。

發明內容

本發明的目的是提供一種α-淀粉酶及其應用，即一種具有工業應用價值的新型α-淀粉酶，以彌補現有技術的不足。

本發明一個方面涉及一種α-淀粉酶，包括有：

a）序列為SEQ?ID?NO：1的酶；

b）在a）中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。

編碼上述α-淀粉酶的核苷酸，其一種序列為SEQ?ID?NO：2。

本發明還提供用于表達上述α-淀粉酶的重組表達質粒，是將序列為SEQ?ID?NO：2的核苷酸片段插入到原核表達載體中構建的。

本發明還涉及攜帶有表達上述α-淀粉酶的重組表達質粒的重組菌。

本發明篩選出的α-淀粉酶在淀粉水解為麥芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的過程中發揮了十分重要的作用，可以用來生產高麥芽糖漿、作為添加劑用于焙烤制品如面包的生產，以及在啤酒、黃酒和生料酒精行業等行業均有不同程度的應用，具有工業生產應用價值。而且篩選出的α-淀粉酶可以用來轉化工程菌，從而獲得具有表達α-淀粉酶的重組菌。

附圖說明

圖1：用于表達本發明的α-淀粉酶的pGm-Pamy質粒圖譜，

圖2：本發明的α-淀粉酶的SDS-PAGE凝膠圖；

圖3：本發明的α-淀粉酶在黑曲霉宿主中的pH穩定性；

圖4：本發明的α-淀粉酶在在黑曲霉宿主中的溫度穩定性。

具體實施方式

下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。但實例僅限于說明，并不限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook）等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。

1、α-淀粉酶Pamy的合成

從繩狀青霉（Penicillium?Funiculosum）全基因組測序得到的蛋白序列中找到繩狀青霉淀粉酶（Penicillium?Funiculosum?amylase）序列。將該序列在NCBI中blast,與已知序列alpha-amylase,putative[Penicillium?marneffei?ATCC?18224]的最高相似度為86%,將繩狀青霉淀粉酶（Penicillium?Funiculosum?amylase）的蛋白序列進行密碼子優化并翻譯成相應的核酸序列Pamy，使Pamy不被XhoⅠ和XbaⅠ兩個酶切位點切斷，在Pamy核酸序列兩端加XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點，將文本序列送至生物公司（上海生工）合成，合成的Pamy被連接在載體PSG-TS上,插入位點為t-a克隆，受體菌為大腸桿菌DH5α菌株。其中本發明的α-淀粉酶的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2，氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。

2、α-淀粉酶Pamy基因重組載體的構建