[發明專利]一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法

有效

• 申請號: 201210281520.5
• 申請日: 2012-08-09
• 公開（公告）號: CN102864220A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 劉西莉;牟文君;李波濤;劉鵬飛;李健強;王厚涵;林東
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02;C12N15/11;C12N15/31;C07K14/37
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法和專用引物。屬于分子生物學技術領域。

背景技術

水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctonia?solani?Kühn)引起的一種世界范圍的水稻病害，該病害引起水稻結實率和千粒重顯著降低，甚至植株倒伏枯死，是造成水稻減產的主要原因之一。水稻紋枯病菌屬于立枯絲核菌的AG-1融合群，其基因組序列未知，這也為該病原菌的深入研究帶來一定困難。隨著矮稈、早熟、多蘗型品種的大量推廣，以及施肥水平的不斷提高，水稻紋枯病危害逐步加重，近年來已成為我國水稻三大病害之首，嚴重影響了水稻產量和質量。

目前對水稻紋枯病的防治以化學措施為主。噻呋酰胺（thifluzamide）商品名為“滿穗”，是陶氏益農公司開發的噻二唑羧酰苯胺類化合物，是近年來推出的新型、高效防治紋枯病藥劑。噻呋酰胺屬于呼吸抑制劑中作用于復合物II處的琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs），這類藥劑還包括萎銹靈、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等，它們具有相似的作用機制和抗性機制，相互間具有正交互抗藥性，多對擔子菌或子囊菌特效。使用初期，這類藥劑因其用藥量少，防效顯著而備受青睞，但因其作用位點單一，田間很快就產生了抗藥性。已有研究發現，病原菌對此類藥劑的抗性機制主要是琥珀酸脫氫酶B、C、D亞基（sdhB、sdhC、sdhD）發生點突變所致，如玉米瘤黑粉病菌、小麥殼針孢葉枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三個半胱氨酸簇的保守組氨酸位點發生點突變，灰蓋鬼傘病菌、菌核病菌等則在膜錨蛋白sdhC、sdhD位點發生點突變，脫氮副球菌在sdhB、sdhD發生點突變，而鏈格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均發生突變。水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的抗性機制目前還未明確，明確其具體的抗性基因及抗性檢測方法，可以對抗性菌株進行早期檢測，了解其抗性發展動態，制定合理的病害管理方案，延緩抗藥性的產生。

傳統的抗性檢測方法主要為室內生物學測定，包括菌絲生長速率法、孢子萌發法、菌絲干重法、水平擴散法等。這些傳統的敏感性測定方法均需要制備含藥培養基，計算抑制中濃度，耗費時間長，工作量大，靈敏度低。隨著分子生物學的快速發展，分子技術得以在抗藥性檢測中應用，其速度快，效率高，是田間抗性檢測的理想方法。針對單堿基突變引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功應用于抗性菌株的分子檢測。等位特異PCR（Allele-Specific?PCR,AS-PCR）是在引物的3’端設計一個堿基與突變位點匹配，在PCR擴增時引物只與突變菌株結合，敏感菌株的DNA則不能擴增，從而將敏感和抗性菌株區分開來。最近的研究發現，在原引物基礎上，改變倒數第二個堿基為不同核苷酸后，可以顯著提高引物的特異性，使得AS-PCR技術應用更為廣泛。CAPS(Cleaved?amplified?polymorphic?sequences)是酶切擴增多態性序列標記技術，也稱為PCR-RFLP技術，敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差異可能導致了酶切位點的改變，對PCR擴增的DNA片段進行限制性酶切，經電泳分離后敏感和抗性菌株的表型不同，從而加以區分。

發明內容

本發明的一個目的是提供兩種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法及其專用引物。

本發明所提供的第一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟：

以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，用SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示引物對進行PCR擴增，若能擴增出條帶，則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點；

所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。

上述過程中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ?ID?NO：4中自5’末端起第975位核苷酸。

上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為56℃。

本發明所提供的另一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟：

以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，擴增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切產物中含有230bp片段，則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點；