[發(fā)明專利]堿性紅G檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210281498.4
• 申請日: 2012-08-08
• 公開（公告）號: CN102798710A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅海英;郭新東;黃金鳳;冼燕萍;侯向昶;吳玉鑾;吳文海;王斌
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577;G01N33/545
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種添加劑檢測技術(shù)，具體來說，特別是涉及一種用于堿性紅G含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

堿性紅G，又名羅丹明6G或玫瑰紅6G，屬酞菁類著色劑，易溶于水和醇，色彩鮮艷，具有優(yōu)良的勻染性和滲染性，用作工業(yè)染色劑。堿性紅G為高毒類化學(xué)物質(zhì)，我國、美國、加拿大、日本、澳大利亞等多國都明確禁止食品和化妝品中使用堿性紅G。因此，快速檢測堿性紅G在食品和化妝品中的含量是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明提供一種堿性紅G檢測試劑盒和一種堿性紅G試劑盒制備方法，該試劑盒在檢測堿性紅G時可一次連續(xù)檢測多個樣品，具有便捷，快速，靈敏、成本低的特點。

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種堿性紅G檢測試劑盒，其技術(shù)方案如下：一種堿性紅G檢測試劑盒，主要包括：

1）包被堿性紅G特異性抗原的酶標(biāo)板：所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)堿性紅G特異性抗原的濃度為1-3μg/mL；

2）堿性紅G特異性抗體溶液：該堿性紅G特異性抗體的濃度為1-3μg/mL；

所述堿性紅G特異性抗原與堿性紅G特異性抗體溶液的用量比為1：1。

在其中一個實施例中，所述堿性紅G檢測試劑盒還包括有酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)二抗是濃度按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗。

在其中一個實施例中，所述堿性紅G特異性抗原的濃度為2μg/mL；所述堿性紅G特異性抗體的濃度為2μg/mL。

在其中一個實施例中，所述堿性紅G檢測試劑盒還包括堿性紅G標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。

在其中一個實施例中，所述特異性堿性紅G特異性抗體是鼠源單克隆抗體；所述堿性紅G特異性抗原為堿性紅G與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述堿性紅G標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L；所述顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0.05%-0.5%吐溫-20的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述酶標(biāo)板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種堿性紅G檢測試劑盒制備方法，主要包括以下步驟：

1）制備包被堿性紅G特異性抗原的酶標(biāo)板：將堿性紅G分散于0.01mol/L鹽酸中，攪拌，堿性紅G的酯基被水解形成羧基；將上述堿性紅G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，攪拌，反應(yīng)產(chǎn)物進行柱層析純化得到中間產(chǎn)物；隨后將中間產(chǎn)物加入三氟乙酸中，回流攪拌，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的堿性紅G的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌，偶聯(lián)制備得到堿性紅G特異性抗原；將堿性紅G特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)堿性紅G特異性抗原的濃度為1-3μg/mL；

2）制備堿性紅G特異性抗體：以步驟1）中合成的堿性紅G特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫后，取血清效價高的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的堿性紅G單克隆抗體；所述堿性紅G特異性抗體的濃度為1-3μg/mL。