[發明專利]堿性紅G檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201210281498.4
• 申請日: 2012-08-08
• 公開（公告）號: CN102798710A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 羅海英;郭新東;黃金鳳;冼燕萍;侯向昶;吳玉鑾;吳文海;王斌
• 申請（專利權）人: 廣州市質量監督檢測研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577;G01N33/545
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

1.一種堿性紅G檢測試劑盒，其特征在于，主要包括：

1）包被堿性紅G特異性抗原的酶標板：所述酶標板的每個微孔內堿性紅G特異性抗原的濃度為1-3μg/mL；

2）堿性紅G特異性抗體溶液：該堿性紅G特異性抗體的濃度為1-3μg/mL；

所述堿性紅G特異性抗原與堿性紅G特異性抗體溶液的用量比為1：1。

2.根據權利要求1所述的堿性紅G檢測試劑盒，其特征在于，還包括有酶標二抗，所述酶標二抗是濃度按1:10000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗。

3.根據權利要求1或2所述的堿性紅G檢測試劑盒，其特征在于，所述堿性紅G特異性抗原的濃度為2μg/mL；所述堿性紅G特異性抗體的濃度為2μg/mL。

4.根據權利要求1所述的堿性紅G檢測試劑盒，其特征在于，還包括堿性紅G標準品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。

5.根據權利要求4所述的堿性紅G檢測試劑盒，其特征在于，所述堿性紅G特異性抗體是鼠源單克隆抗體；所述堿性紅G特異性抗原為堿性紅G與載體蛋白的偶聯物；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述堿性紅G標準品溶液濃度分別為1×10⁵μg/L、1×10⁴μg/L、1×10³μg/L、1×10²μg/L、1×10¹μg/L、0.5μg/L；所述顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；所述終止液為1-2mol/L的硫酸溶液；所述洗滌液為含有0.05%-0.5%吐溫-20的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液；所述酶標板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。

6.一種堿性紅G檢測試劑盒制備方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

1）制備包被堿性紅G特異性抗原的酶標板：將堿性紅G分散于0.01mol/L鹽酸中，攪拌，堿性紅G的酯基被水解形成羧基；將上述堿性紅G羧酸衍生物、N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥DMF中，攪拌，反應產物進行柱層析純化得到中間產物；隨后將中間產物加入三氟乙酸中，回流攪拌，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的堿性紅G的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌，偶聯制備得到堿性紅G特異性抗原；將堿性紅G特異性抗原包被于酶標板中，所述酶標板的每個微孔內堿性紅G特異性抗原的濃度為1-3μg/mL；

2）制備堿性紅G特異性抗體：以步驟1）中合成的堿性紅G特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫后，取血清效價高的小鼠，取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株；并取不完全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的堿性紅G單克隆抗體；所述堿性紅G特異性抗體的濃度為1-3μg/mL。

7.根據權利要求6所述的堿性紅G檢測試劑盒制備方法，其特征在于，步驟1）中，制備堿性紅G特異性抗原的具體方法為：將0.88g堿性紅G分散于50mL的0.01mol/L鹽酸中，55℃攪拌2h，堿性紅G的酯基被水解形成羧基；將0.82g的上述堿性紅G羧酸衍生物、1.2g?N-(3-胺基丙基)氨基甲酸叔丁酯和2.1g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基分散于干燥30mL?DMF中，65℃攪拌1h，反應產物進行柱層析純化得到中間產物；隨后將中間產物加入30倍的三氟乙酸中，回流攪拌1h，脫去叔丁氧酰基的保護，裸露出胺基，制得能夠與蛋白質偶聯的堿性紅G的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合，再與牛血清白蛋白混合，室溫攪拌1h，偶聯制備得到堿性紅G特異性抗原。

8.根據權利要求6所述的堿性紅G檢測試劑盒制備方法，其特征在于，步驟2）為：以步驟1）中合成的堿性紅G特異性抗原作為免疫原對10周齡的Balb/c小鼠進行免疫；首次免疫使用完全弗氏佐劑與堿性紅G特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為0.35mg/mL，劑量為110μg/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與堿性紅G特異性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔10天加強免疫一次，共免疫5-10次，當抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫，最后一次不加免疫佐劑直接用堿性紅G特異性抗原水溶液腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測血清效價；取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細胞按6:1比例與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細胞，得到完全同質的單克隆抗體和穩定的單克隆雜交瘤細胞株；并取Balb/C小鼠，于一周前采用不完全佐劑腹腔注射進行致敏，劑量為0.5mL/只；將細胞濃度為1.4萬/mL的雜交瘤細胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為0.5mL/只；接種雜交瘤細胞7~10天后，收集腹水，反復收集數次；存于4℃冰箱保存；經辛酸-硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的堿性紅G單克隆抗體。