[發(fā)明專利]一種甲型肝炎病毒的提純方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210280517.1
• 申請(qǐng)日: 2012-08-08
• 公開（公告）號(hào): CN102807972A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張現(xiàn)臣;魏文進(jìn);黃秋香;劉雨;包建偉;鐘漢斌;王春雨;孟紅彥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳康泰生物制品股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/02
• 分類號(hào): C12N7/02;A61K39/29;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒提純方法領(lǐng)域，具體地，涉及一種甲型肝炎病毒的提純方法。

背景技術(shù)

甲型肝炎，簡稱甲肝，是由甲型肝炎病毒（HAV）引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的急性傳染病。甲肝主要通過“糞-口”途徑傳播，或個(gè)人間的傳播，或因污染了甲肝病毒的水或者食物從而引起甲肝爆發(fā)。大齡兒童和成人感染甲肝后，70％以上為臨床型感染，病死率為0.3％～0.6％；50歲以上患者的病死率為1.8％；慢性肝病者感染甲肝后，發(fā)生急性肝衰竭的危險(xiǎn)性升高。隨著生活條件的改善，成年人感染甲肝人數(shù)有增多趨勢(shì)，臨床型甲肝比例上升，從而甲肝成為較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

我國是甲型肝炎高發(fā)區(qū)，每年至少有24萬人患甲型肝炎，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)危害，因此，研制并開發(fā)有效的預(yù)防和治療甲型肝炎的疫苗和藥物成為亟待解決的問題。

目前世界上有兩種預(yù)防控制甲肝的疫苗，一種是甲肝減毒活疫苗；另一種是甲肝滅活疫苗。由于各生產(chǎn)廠家使用的甲肝病毒純化工藝不同，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。

目前常見的甲肝病毒分離方法為分子篩層析技術(shù)，該技術(shù)特點(diǎn)是操作相對(duì)簡單，而且生產(chǎn)應(yīng)用已久，但該技術(shù)對(duì)甲肝病毒純化的純度不高，制得的甲肝抗原純度低于50%，使得每劑甲型肝炎滅活疫苗成品中總蛋白濃度高于10μg/ml，這增加了甲型肝炎疫苗的不安全因素，增大了疫苗使用的風(fēng)險(xiǎn)，且增加了成本。因此迫切需要一種對(duì)甲肝病毒純化效果好，病毒純度更高，且單位體積層析膠純化效率高，安全有效的甲型肝炎病毒提純方法以利于大規(guī)模病毒生產(chǎn)純化以供應(yīng)疫苗生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種甲型肝炎病毒的提純方法，以克服上述不足。

本發(fā)明使用的甲型肝炎病毒SH株，其保藏編號(hào)為CGMCC?No.4501，已公開在中國專利CN102174477A中。

本發(fā)明提供一種甲型肝炎病毒的提純方法，包括以下步驟：

1）甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)液超聲破碎，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清液；

2）氯仿抽提上清液，得到粗制病毒液；

3）將粗制病毒液超濾濃縮，緩沖鹽溶液洗脫超濾膜；

4）疏水層析純化濃縮病毒液；

5）病毒液的檢測(cè)與收集。

其中，步驟1）所述甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)液超聲破碎是將抗原滴度達(dá)到1：256-1024的甲型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)液在冰浴條件下超聲破碎。

其中，步驟1）所述所述超聲破碎使用的超聲破碎儀功率為500-1500w，輸出功率為50%-95%，破碎次數(shù)為4-6次。

其中，所述步驟1）的離心方法為3500-4500r/min，離心5min-10min。

其中，所述步驟2）氯仿抽提是將氯仿按體積比為1:1-3加入上清液振搖，然后3500-4500r/min離心后吸取上層水相，如此重復(fù)抽提4-6次；將蛋白相和氯仿再用抽提緩沖液抽提并吸取上層水相，合并上層水相得到粗制病毒液。

其中，所述的抽提緩沖液為120mM?NaCl或6.2mM?PBS。

其中，所述步驟3）超濾濃縮的倍數(shù)為10-30倍，超濾膜的截留分子量為50-100KD。

其中，所述步驟3）緩沖鹽溶液為2-4mol/L的PBS溶液，pH7.2。

其中，所述步驟4）層析方法為：每次上樣量為1000-2000ml，上樣緩沖液為2mol/L?PBS，pH7.2，洗脫緩沖液為0.5mol/L?PBS，pH7.2，流速為15ml/min。

進(jìn)一步地，用280nm波長對(duì)平衡好的柱上洗脫病毒液進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明提供了上述甲型肝炎病毒提純方法在制備甲型肝炎疫苗中的應(yīng)用。

將通過疏水層析步驟收集到的病毒液進(jìn)行滅活，按照體積比1:4000-5000將甲醛添加入病毒液中，37℃恒溫，旋轉(zhuǎn)12-15天完成滅活過程。

滅活甲型肝炎病毒根據(jù)效價(jià)稀配后經(jīng)無菌、效力、異常毒性、細(xì)菌內(nèi)毒素等檢查后即為甲型肝炎病毒疫苗制品。