[發明專利]一種酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的檢測方法

有效

• 申請號: 201210278074.2
• 申請日: 2012-08-07
• 公開（公告）號: CN102818779A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 張心青;楊傳倫;王秀芝;徐澤平;高洪奎
• 申請（專利權）人: 黃河三角洲京博化工研究院有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術領域

本發明涉及一種酵母葡聚糖含量的檢測方法，具體涉及一種酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的檢測方法。

背景技術

酵母細胞中除含有大量的蛋白質外，還含有甘露聚糖、甘露糖蛋白、β-1,3-葡聚糖、其他雜多糖和幾丁質等成分。目前已被應用的酵母多糖產品主要有甘露糖系列的甘露聚糖、甘露寡糖、甘露糖蛋白，含多種多糖成分的酵母葡聚糖，非水溶性的酵母細胞壁β-1,3-D-葡聚糖等。

目前，對于酵母葡聚糖含量的檢測方法有很多，都是對于酵母葡聚糖中水溶性葡聚糖含量的檢測方法，如利用多糖的還原性測定還原性多糖的方法有3，5一二硝基水楊酸鹽比色法；利用多糖在強酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，然后再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質的這一性質進行測定，這類方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其中非水溶性多糖很難徹底水解，若高溫水解則會破壞目的組分，無法用于產品質量的檢驗、監督，使得酵母非水溶活性多糖產品的質量控制、生產過程中非水溶活性多糖的檢測產生了很大的不確定性。國外常用酶法檢測法檢測非水溶性葡聚糖的含量，利用專一性酶對多糖底物的催化反應確認是否含有非水溶性葡聚糖，再結合其他方法測定非水溶性葡聚糖含量，但是此方法條件苛刻，對設備要求高，不適合一般實驗室操作。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供了一種酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的檢測方法，采用特殊工藝除去單糖、低聚糖、水溶性雜多糖以及蛋白的干擾，采用合理的酸降解、水解，能夠將非水溶性葡聚糖完全轉化為水溶性葡聚糖，有效地解決了非水溶性葡聚糖難以降解或降解不完全的缺陷，減少了降解時間，降低了水解溫度，為酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量檢測提供了依據。?

一種酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的檢測方法，主要步驟包括：順次經過除去堿溶性成分、除去酸溶性成分、濃酸降解、稀酸水解，將非水溶性葡聚糖完全轉化為水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法測定非水溶性葡聚糖的含量，并對檢測方法進行精密度和回收率研究，具體步驟包括：

（1）除去堿溶性成分

取烘干粉碎的待測多糖樣品，分別稱取20-200mg于3-5個離心杯中，分別加入堿溶液，充分震蕩5-10min，離心5-20min，棄去上清液，如此重復2次；

（2）去除酸溶性成分

向步驟（1）中棄去上清液的3-5個離心杯中，分別加入酸溶液，充分震蕩5-10min，離心5-20min，棄去上清液，如此重復2次；

（3）濃酸降解

將步驟（2）中棄去上清液的3-5個離心杯中的沉淀分別轉移到相應的100mL碘量瓶中，分別向各個碘量瓶加入酸溶液，充分震蕩2-5min，室溫放置20-30min；

（4）稀酸水解

向經步驟（3）酸處理后的3-5個碘量瓶中分別加入40mL-80mL水，接上冷凝管，100℃水解2-6小時，取出，冷水浴中降溫到室溫，分別轉移到100mL容量瓶中，并定容得待測樣品溶液；

（5）苯酚-硫酸法測定非水溶葡聚糖含量

配制50g/L的苯酚溶液：稱取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀釋至100mL，混勻，置冰箱中保存，備用；

配制葡聚糖標準儲備溶液：精密稱取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖標準品P82?0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混勻，置冰箱中保存；

配制葡聚糖標準溶液：吸取葡聚糖標準儲備液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存；

標準曲線繪制：精密吸取葡聚糖標準溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL分別置于25mL比色管中，準確補充水至2.0mL，加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸10min，冷卻后用分光光度計在490nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖的質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得出標準曲線的回歸方程為：y=4.405x-0.0031，R²=0.9997

式中y為葡聚糖的質量濃度，單位為mg/mL，x為吸光度值，R為線性相關系數；