[發明專利]一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法

有效

• 申請號: 201210277340.X
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN102850447A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 張耀洲;楊波;張小蓓;陳劍清;舒特俊
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

技術領域

本發明涉及一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，屬于蛋白質純化技術領域。

背景技術

膜蛋白(特別是膜內在蛋白)在生物體與外界環境進行物質和能量的交換以及信號傳遞等方面起著非常重要的作用。并且大部分膜蛋白是研究新藥的潛在靶點，是新藥研發的重要領域之一。

常規研究的膜蛋白大部分都是原核表達后獲取的，所以不具有翻譯后修飾，天然蛋白具有最真實的糖基化修飾和空間結構，是最接近該蛋白的生物活性的，因此純化天然膜蛋白具有重要意義。

但是純化天然膜蛋白有三個難點，第一個是富集大量膜蛋白，第二個是有效地溶解膜蛋白，第三個是有效地純化方法。我們利用細胞膜表面HA活性標記可以拿到大量的膜蛋白組分，篩選出有效地去垢劑及其濃度去溶解膜蛋白，最后用一系列色譜柱分級純化目的蛋白。整個方案對膜蛋白的純化方法起到一定的推進作用。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，其利用細胞膜表面HA活性標記可以獲取膜蛋白含量高的組分，并利用各種層析技術進一步富集我們的目標蛋白。

為達到上述目的，本發明提供一種家蠶天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，包括以下步驟：

(1)制備家蠶生物膜組分：將500g蠶蛹粉(保存于4℃)與1500ml(4℃預冷)的滅菌ddH2O混合勻漿2?min，停2?min，置于冰上冷卻，重復9次；8000?rpm?4℃離心60min，重復3次；上清15000?rpm?4℃離心60?min，重復3次，最后一次4層紗布過濾；過濾上清液進行0.1μm膜包超濾(料液比：1:1)，重復10次，恢復到原體積；上清液50000rpm?10℃離心40分鐘。上清密度梯度離心；鋪制蔗糖密度：PB(150ml)，樣品(350ml)，30?wt%(400ml)，40wt?%(400ml)，55%充滿，30000rpm密度梯度離心3?h；用56%蔗糖溶液下樣，按30ml/管收集(取樣3ml)，做比活測定；將區帶離心后收集的樣品進行測活；將活性高的膜組分混合，分別用超濾液100kD膜包超濾10次脫糖;

(2)利用去垢劑提取家蠶天然膜蛋白：將脫好糖的細胞膜組分與膜蛋白提取液(含1%的去垢劑CHAPS)按體積比1:2的比例混合，4℃輕微攪拌8小時左右；將提取好的膜蛋白混合液于8000?rpm離心20分鐘后取上清，準備裝柱過陰離子交換；

(3)分級純化家蠶天然膜蛋白PRMC2：將準備好的蛋白樣品600ml在4度與280mlDEAE填料緩慢均勻攪拌混合，每隔10分鐘攪拌一次，共混合2小時，每次裝柱前都應將填料攪拌均勻，同時將柱子下方出樣口打開，并收集流出液，直到柱子全部裝好(特別要注意整個裝柱過程禁止填料干掉)；將裝好的DEAE柱連接到AKTA液相色譜儀上后，用20mMTris平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl濃度的方法進行分布洗脫；共出現4個大峰，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用SuperdexTM?200(分子篩層析)進一步分離，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用RESCOURCE?Q(分子篩層析)，1?mL進一步梯度洗脫分離，共分得7個峰，并對每個峰走電泳檢測，以獲得較純的家蠶天然膜蛋白PRMC2。

本發明利用家蠶桿狀病毒在細胞的感染初期以出芽病毒的方式穿過細胞膜,被病毒穿膜后的破碎細胞膜融合后形成各種囊泡，經過低速離心，超速離心，密度梯度離心等一系列操作，可以有效地分離細胞膜成分，同時以HA活性為Marker標定細胞膜，從而有效獲得膜蛋白質；也為我們更好的拿到高含量膜蛋白組分提供了很好的解決方法，這是一種全新的有效的膜蛋白分離技術，具有重要的意義。

附圖說明

圖1是將區帶離心后收集的樣品進行測活，1，2，3，4，5，6，7，8：區帶后收集的樣品，9為區帶前的樣品，并倍比稀釋8個孔，NC為陰性對照，結果顯示1，2，3，5，6，7樣品HA活性較高；

圖2是家蠶天然膜蛋白PRMC2的DEAE(300ml)離子交換初步分離色譜圖；

圖3是DEAE(300ml)分離天然膜蛋白PRMC2的電泳分析圖；M:低分子質量蛋白質標準；1:原樣(膜蛋白提取液提取后的蛋白組分)；2：穿透液；4：第4管產物；5：第5管產物；17:第17管產物；21：第21管產物；25:第25管產物；32：第32管產物；其中家蠶天然膜蛋白PRMC2在第17管中；