[發明專利]一種家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法

有效

• 申請號: 201210277340.X
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN102850447A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 張耀洲;楊波;張小蓓;陳劍清;舒特俊
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種家蠶天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種權利要求1所述的家蠶天然膜蛋白PRMC2的純化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)制備家蠶生物膜組分；

(2)利用去垢劑提取家蠶天然膜蛋白PRMC2；

(3)分級純化所述家蠶天然膜蛋白PRMC2。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體包括：將保存于-80℃的蠶蛹粉與4℃預冷的滅菌ddH₂O等體積混合勻漿2?min，停2?min，置于冰上冷卻，重復9次；8000?rpm、4℃離心60min，重復3次；上清于15000?rpm、4℃離心60?min，重復3次，最后一次4層紗布過濾；過濾上清液進行0.1μm膜包超濾，其中料液體積比為1:1，重復10次，體積恢復到過濾前體積；上清液于50000rpm，10℃離心40分鐘；上清密度梯度離心；鋪制蔗糖密度：PB?(150ml)，樣品(350ml)，30wt?%(400ml)，40wt?%(400ml)，55%充滿，30000rpm密度梯度離心3?h；用56%蔗糖溶液下樣，按30ml/管收集，取樣3ml，做比活測定；將區帶離心后收集的樣品進行測活；將活性高的膜組分混合，分別用超濾液100kD膜包超濾10次脫糖。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括：將脫好糖的細胞膜組分與膜蛋白提取液按體積比1:2的比例混合，4℃輕微攪拌過夜至少8小時；將提取好的膜蛋白混合液于8000?rpm離心20分鐘后取上清，準備裝柱過陰離子交換。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括：將準備好的蛋白樣品600ml在4℃與280mlDEAE填料緩慢均勻攪拌混合，每隔10分鐘攪拌一次，共混合2小時，每次裝柱前都應將填料攪拌均勻，同時將柱子下方出樣口打開，并收集流出液，直到柱子全部裝好；將裝好的DEAE柱連接到AKTA液相色譜儀上后，用20mMTris平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl濃度的方法進行分布洗脫，共出現4個大峰，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用SuperdexTM?200進一步分離，并對每個峰走電泳檢測；將含有目的蛋白的峰收集濃縮，用RESCOURCE?Q，1?mL進一步梯度洗脫分離，共分得7個峰，并對每個峰走電泳檢測，以獲得較純的家蠶天然膜蛋白PRMC2。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述膜蛋白提取液含有1%的去垢劑CHAPS。