[發明專利]大分子活性膠原蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201210276450.4
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN103571901A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 郁帥陸;黃榮醒;林琳
• 申請（專利權）人: 江蘇奧普萊醫療用品有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34;C07K1/14
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明涉及生物醫用材料的制備領域，具體涉及一種大分子活性膠原蛋白的制備方法。

背景技術

膠原蛋白是具有獨特結構的一族蛋白質，廣泛存在于哺乳動物組織中，約占總蛋白質的30%以上。膠原蛋白為骨、皮膚、肌腱和韌帶提供生物力學性能、控制發育中的細胞基因表型。膠原蛋白的結構呈三股螺旋結構，由三條多肽鏈組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型，三條左手螺旋α-鏈又互相纏成右手螺旋結構——即超螺旋結構。單個α-鏈含有至少一個Gly-X-Y序列。每三個氨基酸就有一個甘氨酸殘基。膠原蛋白的特有結構和化學組成使其具有許多獨特性質和功能。這些性質和功能使其在各個領域得到了廣泛應用，如生物醫學材料、藥物輸送載體、組織工程、化妝品和食品等領域。

目前，國內活性膠原蛋白雖有科研單位進行了研究和開發，并有一些活性膠原蛋白提取工藝方面的專利與報道，但目前離產業化水平仍有一定差距，只限于少數幾家公司能夠進行中試或小規模試生產。由于活性膠原蛋白產業化水平較低，限制了它的下游產品開發與應用。目前，活性膠原蛋白在保健食品、化妝品領域中的應用有大量報道和銷售，但對于醫用級大分子量活性膠原蛋白的提取技術僅處于小規模水平。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種大分子活性膠原蛋白的制備方法。

本發明采用的技術方案為：一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

一、魚皮的預處理

????選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20-30%?NaCI(0.05M?Tris-HCI，pH7.5)溶液中(1:20-40，w/v)均質5-10min，用轉速為10000-15000rpm高速冷凍離心機離心10-25min，取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗；

二、活性膠原蛋白的提取

????將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中（1:50-100，w/v），冰浴，加入乙酸至0.5-1.0M超聲10-25min，超聲波功率300-600W，加入0.1-0.5重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數種，酶解5-8h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水（1:50-100），調pH值至中性，加入0.1-0.5重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解3-6h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液；

三、活性膠原蛋白溶液的純化

選孔徑為10-50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀，沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心1-2h，取上清，對0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原蛋白溶液。

有益效果：本發明通過超聲波、乙酸和復合酶的協同作用提取膠原蛋白，并綜合運用鹽析、透析和超濾技術制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩定存在。

具體實施方式

下面對本發明的具體實施方式進行詳細的說明。

實施例1：選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20%?NaCI(0.05M?Tris-HCI，pH7.5)溶液中(1:20，w/v)均質5min，用轉速為10000rpm高速冷凍離心機離心10min，取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗。將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中（1:50，w/v），冰浴，加入乙酸至0.5M超聲10min，超聲波功率300W。加入0.1重量份胃蛋白酶，酶解5h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水（1:50），調pH值至中性，加入0.1重量份中性蛋白酶，酶解3h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為10nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5M，鹽析過夜，然后離心10min，取沉淀。沉淀再次用0.5M乙酸溶解后，離心1h，取上清，對0.1M乙酸透析脫鹽，用100nm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為20%的大分子活性膠原蛋白溶液。