[發明專利]一種抗菌劑及其制備方法

無效

• 申請號: 201210275946.X
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN102787138A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 朱姍穎;曹青;何華綱;王文兵
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;A61K39/12;A61P31/04
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程領域。特別涉及一種抗菌劑及其制備方法。

背景技術

抗生素是用于治療各種細菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。重復使用一種抗生素可能會使致病菌產生耐藥性。目前，人們對抗生素的高使用頻率和高使用劑量使得細菌耐藥性問題越來越突出。為防止和減少致病菌耐藥性的產生，一方面我們應堅持合理用藥，杜絕濫用抗生素，另一方面要不斷改進和研制新的抗菌藥物。

抗菌肽是廣泛分布于生物體內的一類多肽分子，分子量通常為2000~7000Da左右，由20~60個氨基酸殘基組成?？咕木哂袕V譜抗菌活性，對細菌有很強的殺傷作用，尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了研究者的關注。另外，人們還發現，某些抗菌肽對部分病毒、真菌、原蟲和癌細胞等具有殺滅作用，甚至能提高免疫力、加速傷口愈合等過程。因此，抗菌肽的廣泛的生物學活性顯示了其在醫學上良好的應用前景。

抗菌肽在自然界中廣泛存在，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發現并分離獲得了抗菌肽。但目前抗菌肽的提取過程費時、工藝復雜、費用昂貴、產量低，無法實現大規模生產，這成為制約抗菌肽進入實際應用的最大障礙。因此，開展抗菌肽基因工程研究具有重要意義。目前，已進入臨床應用的基因工程藥物多數是采用原核表達系統生產的，但由于抗菌肽對細菌的殺傷作用，不能用原核表達系統直接表達具有生物活性的抗菌肽。國內研究者大量研究表明，利用酵母表達抗菌肽是一條可行的道路，但表達產率仍有待進一步提高。

芋螺毒素（conotoxin，CTL）是由海洋軟體動物芋螺（Conus）分泌的一類用于自衛和捕食的活性肽類毒素，能特異性地作用于鉀、鈉、鈣等離子通道、細胞膜上的各種神經遞質和激素的受體，從而干擾細胞或神經中的信號傳遞。芋螺毒素分子質量小，通常由10~30個氨基酸殘基組成。研究發現，盡管芋螺毒素種類繁多，序列多變，但它們的信號肽序列卻非常保守。同時，成熟肽中富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。1992年，Eldridge?等人在苜蓿尺蠖核型多角體病毒（Autographa?californica??multiple?nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）中發現了一種與芋螺毒素結構非常類似的小分子肽，根據其保守的結構特點命名為類芋螺毒素（conotoxin-like，CTL）。序列比對發現，在目前已測序的桿狀病毒中超過三分之一的病毒含有ctl基因。但到目前為止，還沒有研究揭示其在體內和體外的任何功能。

我們利用PCR技術從AcMNPV中克隆到ctl基因，進而構建重組桿狀病毒，感染離體昆蟲細胞后，發現胞外產物對金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等多種臨床致病菌具有抑制活性，在醫藥、食品等領域具有潛在的應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抗菌劑及其制備方法。

本發明公開了一種含有ctl基因、Pie1啟動子的中間載體pFastBac-Pie1-ctl，它的結構如圖2所示。所述中間載體pFastBac-Pie1-ctl是通過下述方法構建得到：

（1）根據苜蓿尺蠖核型多角體病毒（AcMNPV）的ctl基因設計一對引物，以AcMNPV基因組DNA作為模板進行PCR擴增，反應條件為：?94℃?4min；?94℃?20s，62℃?30s，72?℃?30s,?30個循環；72℃?7min。瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，將ctl基因連入pMD18-T?形成重組質粒pMD18-T-ctl；

（2）利用SnaBI和BamHI將家蠶核型多角體病毒（BmNPV）的Pie1啟動子取代pFastBac1上原有的多角體基因啟動子，得到pFastBac1-Pie1；用BamHI和KpnI切割重組質粒pMD18-T-ctl，回收ctl片段，克隆到經同樣雙酶切的pFastBac1-Pie1，將ctl基因置于Pie1啟動子下游，構建出中間載體pFastBac-Pie1-ctl。

本發明所述抗菌劑，通過以下步驟制備得到：

（1）制備含有類芋螺毒素（ctl）基因的中間載體pFastBac-Pie1-ctl，所述中間載體包括來自家蠶核型多角體病毒（BmNPV）早期啟動子Pie1、來自苜蓿尺蠖核型多角體病毒（AcMNPV）的ctl基因；