[發(fā)明專利]一種水中兩蟲的富集、純化方法及其含量的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210275179.2
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN103571751A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設計）人: 于建偉;周美芝;楊敏;張冬青
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12Q1/06;C12R1/90
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權代理事務所 11308
• 代理人: 葉凡

技術領域

本發(fā)明涉及的是一種水中檢測技術領域的方法，具體是一種濁水中隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊的富集、純化方法及其在濁水中含量的檢測方法。?

背景技術

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲(即“兩蟲”)是兩種寄生于人和動物體內的致病性原生動物，近年來國外出現(xiàn)了多次由于水中“兩蟲”所導致的介水疾病的暴發(fā)，其危害已經(jīng)引起了廣泛的重視。我國修訂的《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB5947-2006)中，在微生物指標部分增加了對隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的檢測，明確規(guī)定其限值＜1個/10L。?

通過對現(xiàn)有技術的檢索發(fā)現(xiàn)，對于水中“兩蟲”的檢測都是通過水樣過濾濃縮，分離純化，染色及鏡檢這幾個主要步驟來完成實現(xiàn)的，其中最為常用的檢測方法是采用美國的EPA?1623方法(“EPA1623方法”是由美國國家環(huán)保局制定的用于測定水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的標準方法)。我國飲用水衛(wèi)生標準檢測方法中也參考采用了該方法。該方法采用濾筒/濾囊過濾，免疫磁珠分離(IMS)和免疫熒光染色顯微觀察，利用微分干涉來檢測和計數(shù)隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，通過顯微鏡觀察確認，該方法實驗條件要求較高，同時檢測成本昂貴，如需用專用的濾囊/濾芯以及免疫磁珠分離試劑盒等。日本對檢測環(huán)境水樣中的“兩蟲”方法進行了改進，用膜過濾-丙酮溶解這一操作步驟優(yōu)替代1623中的濾筒/濾囊過濾，避免了洗脫過程中“兩蟲”的流失，提高了回收率。然而當水源水中濁度較高條件下，無論采用濾囊/濾芯或膜過濾的方式進行濃縮，往往需要多個濾囊/濾芯或濾膜進行，不僅操作上麻煩，而且實驗耗費較大；同時由于得到過多的沉淀，不利于隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊的進一步分離純化，導致回收率不高。因此有必要針對混濁水條件下開發(fā)一種操作方便，且成本不高的富集及分離純化方法，濁水中隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊的富集、純化方法及其在濁水中含量的檢測方法。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術中存在的問題和不足，提供一種水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的富集、分離純化及其含量的檢測方法，本發(fā)明方法中“兩蟲”的回收率高，背景雜質干擾少，測定結果準確，同時本發(fā)明不需要昂貴的儀器設備、耗材，操作簡便，達到了降低測試成本的目的。?

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的富集和分離純化方法，包括如下順序進行的步驟：?

(1)沉降、富集處理?

向水樣中加入氯化鈣和碳酸氫鈉，然后調節(jié)水的pH值，在堿性條件下隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲隨著生成的碳酸鈣沉淀一起沉降，得到隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀；?

(2)酸解離處理?

向隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀中加入酸性物質，酸解離處理，碳酸鈣沉淀溶解，得到酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀；?

(3)純化處理?

向酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲懸浮液，接著向懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質，然后進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中間層，即得純化的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲。?

其中，步驟(1)中所述水樣的濁度≥20NTU，所述水的濁度優(yōu)選為20-100NTU，進一步優(yōu)選為20-60NTU；向水中加入等摩爾量的氯化鈣和碳酸氫鈉；調節(jié)水的pH值為9.50-10.50，優(yōu)選為10.00±0.05。?

特別是，每10L水中添加0.1-0.2mol的所述氯化鈣；沉降時間為12-24h。?

尤其是，所述氯化鈣選用氯化鈣溶液；所述碳酸氫鈉選用碳酸氫鈉溶液。?

其中，采用向水樣中加入氫氧化鈉進行所述水樣的pH調節(jié)。?

特別是，采用濃度為1-10mol/L的氫氧化鈉溶液條件水樣的pH值，氫氧化鈉溶液的濃度優(yōu)選為10mol/L。?

特別是，所述氯化鈣溶液的濃度為1-10mol/L，優(yōu)選為1mol/L；所述碳酸氫鈉溶液的濃度為1-10mol/L，優(yōu)選為1mol/L。?

特別是，還包括沉降后去除上清液，得到濃縮富集的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀。

其中，步驟(2)中所述酸性物質的物質的量為0.2-0.4mol，即酸性物質的摩爾數(shù)?為0.2-0.4mol。?

特別是，所述酸性物質選擇氨基磺酸溶液、鹽酸溶液或醋酸溶液，優(yōu)選為氨基磺酸溶液。?

尤其是，所述氨基磺酸溶液的濃度為1-10mol/L，優(yōu)選為1mol/L；每10L水中添加0.2-0.4mol所述氨基磺酸。?

特別是，在2000g，4℃下進行所述離心處理10min。?