[發明專利]一種水中兩蟲的富集、純化方法及其含量的測定方法

有效

• 申請號: 201210275179.2
• 申請日: 2012-08-06
• 公開（公告）號: CN103571751A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 于建偉;周美芝;楊敏;張冬青
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12Q1/06;C12R1/90
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 葉凡

1.一種水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的富集和純化方法，包括如下順序進行的步驟：

1)沉降、富集處理

向水樣中加入氯化鈣和碳酸氫鈉，然后調節水樣的pH，在堿性條件下隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲隨著生成的碳酸鈣沉淀一起沉降，得到隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀；

2)酸解離處理

向隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀中加入酸性物質，酸解離處理，碳酸鈣沉淀溶解，得到酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀；

(3)純化處理

向酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲懸浮液，接著向懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質，然后進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中間層，得純化的隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(1)中所述水樣的濁度≥20NTU。

3.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(1)中每10L水樣中加入0.1-0.2mol的氯化鈣。

4.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(1)中調節水的pH值為9.50-10.50。

5.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(2)中每10L水樣中加入0.2-0.4mol的酸性物質。

6.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(3)中所述磷酸鹽-吐溫緩沖溶液按照如下步驟制備而成：

A)按照如下用量備料(以1L水量計)

NaCl??????????????8.0g

Na₂HPO₄·12H₂O????2.9g

KCl????????????0.2g

KH₂PO₄?????????0.2g

B)將上述原料加入到1000mL純水中，攪拌溶解均勻后，調節pH到7.2-7.4，制得磷酸鹽緩沖溶液；

C)向磷酸鹽緩沖溶液中加入吐溫80，攪拌混勻，即得，其中每100mL磷酸鹽緩沖溶液中加入0.01-0.2mL的吐溫80。

7.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(3)中加入的磷酸鹽-吐溫緩沖溶液的體積與所述酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀的體積之比為10-30∶1。

8.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(3)中所述Percoll-蔗糖介質的密度為1.10-1.15g/cm³。

9.如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟(3)中加入的Percoll-蔗糖介質與所述隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲懸浮液的體積之比為1∶2。

10.一種水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的測定方法，包括如下順序進行的步驟：

(1)沉降、富集處理

向水樣中加入氯化鈣和碳酸氫鈉，然后加入氫氧化鈉調節水的pH值至堿性，在堿性條件下隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲隨著生成的碳酸鈣沉淀一起沉降，得到隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀；

(2)酸解離處理

向隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀中加入酸性物質，酸解離處理，碳酸鈣沉淀溶解，得到酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀；

(3)純化處理

向酸解離隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲沉淀中加入磷酸鹽-吐溫緩沖溶液，混勻，制成隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲懸浮液，接著向懸浮液中加入Percoll-蔗糖介質，然后進行密度梯度離心處理，離心混合液分為3層，取中間層，得隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲純化液；

(4)染色、鏡檢

首先，對隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲純化液進行過濾處理，接著進行染色處理，然后置于顯微鏡下觀察，鏡檢計數。